Ekspresja genów i małe RNA w onkologii. Zobacz, co oznacza „mały RNA” w innych słownikach mikro-RNA w onkologii

Naukowcy uważają, że nieprawidłowa ekspresja małych RNA jest jedną z przyczyn szeregu chorób, które poważnie wpływają na zdrowie wielu ludzi na całym świecie. Choroby te obejmują choroby układu krążenia 23 i nowotwory 24 . Jeśli chodzi o to drugie, nie jest to zaskakujące: rak wskazuje na nieprawidłowości w rozwoju komórek i ich losie, a małe RNA odgrywają kluczową rolę w odpowiednich procesach. Oto jeden z najbardziej znaczących przykładów ogromnego wpływu, jaki małe RNA mają na organizm podczas choroby nowotworowej. Mówimy o nowotworze złośliwym, który charakteryzuje się nieprawidłową ekspresją tych genów, które działają w początkowym rozwoju organizmu, a nie w okresie poporodowym. Jest to rodzaj guza mózgu u dzieci, który zwykle pojawia się przed drugim rokiem życia. Niestety jest to bardzo agresywna postać nowotworu i rokowanie w tym przypadku jest niekorzystne nawet przy intensywnym leczeniu. Proces onkologiczny rozwija się z powodu niewłaściwej redystrybucji materiału genetycznego w komórkach mózgowych. Promotor, który normalnie kieruje silną ekspresją jednego z genów kodujących białka, ulega rekombinacji ze specyficznym skupiskiem małych RNA. Następnie cały ten przeorganizowany region ulega amplifikacji, innymi słowy w genomie powstaje wiele jego kopii. W rezultacie małe RNA zlokalizowane „poniżej” przeniesionego promotora ulegają ekspresji znacznie silniej, niż powinny. Poziom aktywnych małych RNA jest około 150-1000 razy wyższy niż normalnie.

Ryż. 18.3. Małe RNA aktywowane przez alkohol mogą łączyć się z informacyjnymi RNA, które nie wpływają na odporność organizmu na działanie alkoholu. Jednak te małe RNA nie wiążą się z cząsteczkami informacyjnego RNA, które promują taką oporność. Powoduje to względną przewagę proporcji cząsteczek informacyjnego RNA kodujących zmiany białek związane z tolerancją alkoholu.

Klaster ten koduje ponad 40 różnych małych RNA. W rzeczywistości jest to na ogół największe tego typu skupisko spotykane u naczelnych. Zwykle ulega ekspresji dopiero na wczesnym etapie rozwoju człowieka, w pierwszych 8 tygodniach życia embrionalnego. Jego silna aktywacja w mózgu niemowlęcia prowadzi do katastrofalnego wpływu na ekspresję genetyczną. Jedną z konsekwencji jest ekspresja białka epigenetycznego, które dodaje modyfikacje do DNA. Prowadzi to do rozległych zmian w całym wzorze metylacji DNA, a tym samym do nieprawidłowej ekspresji wszelkiego rodzaju genów, z których wiele powinno ulegać ekspresji jedynie podczas podziału niedojrzałych komórek mózgowych we wczesnych stadiach rozwoju. Tak rozpoczyna się program nowotworowy w komórkach dziecka 25.

Taka komunikacja między małymi RNA a maszynerią epigenetyczną komórki może mieć znaczący wpływ na inne sytuacje, w których komórki rozwijają predyspozycję do raka. Mechanizm ten prawdopodobnie skutkuje wzmocnieniem efektu zakłócenia ekspresji małego RNA w wyniku zmian w modyfikacjach epigenetycznych, które są przekazywane komórkom potomnym od matki. Może to stworzyć wzór potencjalnie niebezpiecznych zmian we wzorze ekspresji genów.

Jak dotąd naukowcy nie odkryli wszystkich etapów interakcji małych RNA z procesami epigenetycznymi, ale nadal mogą uzyskać pewne wskazówki na temat cech tego, co się dzieje. Okazało się na przykład, że pewna klasa małych RNA, które zwiększają agresywność raka piersi, celuje w określone enzymy w informacyjnym RNA, które usuwają kluczowe modyfikacje epigenetyczne. Zmienia to wzór modyfikacji epigenetycznych w komórce nowotworowej i dodatkowo zakłóca ekspresję genetyczną26.

Wiele form raka jest trudnych do wyśledzenia u pacjenta. Procesy onkologiczne mogą zachodzić w trudno dostępnych miejscach, co komplikuje procedurę pobierania próbek. W takich przypadkach lekarzowi nie jest łatwo monitorować rozwój procesu nowotworowego i reakcję na leczenie. Często lekarze zmuszeni są polegać na pomiarach pośrednich - powiedzmy na tomograficznym skanie guza. Niektórzy badacze uważają, że małe cząsteczki RNA mogłyby pomóc w stworzeniu nowej techniki monitorowania rozwoju nowotworu, która mogłaby również badać jego pochodzenie. Kiedy komórki nowotworowe umierają, małe RNA opuszczają komórkę po jej pęknięciu. Te małe cząsteczki śmieci często tworzą kompleksy z białkami komórkowymi lub są owinięte we fragmenty błon komórkowych. Dzięki temu są bardzo stabilne w płynach ustrojowych, co oznacza, że ​​takie RNA można izolować i analizować. Ponieważ ich ilości są małe, badacze będą musieli zastosować bardzo czułe metody analizy. Jednak nie ma tu rzeczy niemożliwych: czułość sekwencjonowania kwasów nukleinowych stale rośnie 27 . Opublikowano dane potwierdzające skuteczność tego podejścia w odniesieniu do raka piersi 28 , raka jajnika 29 i szeregu innych chorób onkologicznych. Analiza małych krążących RNA u pacjentów z rakiem płuc wykazała, że ​​RNA te pomagają rozróżnić pacjentów z pojedynczym guzkiem płuc (niewymagającym leczenia) od pacjentów, u których rozwinęły się guzki nowotworu złośliwego (wymagającego leczenia) 30 .

Artykuł na konkurs „bio/mol/text”: W ostatnie lata RNA – a zwłaszcza jego „nieklasyczne” odmiany – przyciąga uwagę biologów na całym świecie. Okazało się, że regulacja przez niekodujące RNA jest powszechna – od wirusów i bakterii po ludzi. Badanie różnorodności regulatorów małego bakteryjnego RNA wyraźnie wykazało ich ważną rolę zarówno w metabolizmie pośrednim, jak i odpowiedziach adaptacyjnych. W artykule opisano rodzaje małych RNA bakterii oraz mechanizmy regulacyjne realizowane za ich pomocą. Szczególny nacisk położony jest na rolę tych cząsteczek w życiu czynników bakteryjnych powodujących szczególnie niebezpieczne infekcje.

RNA: więcej niż tylko kopia DNA

Większość czytelników tej witryny zna podstawowe mechanizmy żywej komórki od czasów szkolnych. Na kursach biologii, od praw Mendla po najnowocześniejsze projekty sekwencjonowania genomu, czerwona nić przewija się przez ideę głównego programu genetycznego na rzecz rozwoju organizmu, znanego zawodowym biologom jako centralny dogmat biologii molekularnej. Mówi, że cząsteczka DNA pełni rolę nośnika i strażnika Informacja genetyczna, który poprzez pośrednika - informacyjny RNA (mRNA) i przy udziale rybosomalnego (rRNA) i transferowego RNA (tRNA) - realizowany jest w postaci białek. Te ostatnie określają gatunek i indywidualny fenotyp.

Ten stan rzeczy i przypisanie RNA roli drugorzędnego uczestnika molekularnego funkcjonowania utrzymał się w środowisku naukowym aż do lat 80-tych ubiegłego wieku. Praca T. Cheka, który wykazał, że RNA może pełnić funkcję katalizatora reakcji chemicznych, zmusiła nas do bliższego przyjrzenia się RNA. Wcześniej uważano, że przyspieszenie procesy chemiczne w komórce - przywilej enzymów, które mają wyłącznie charakter białkowy. Odkrycie aktywności katalitycznej w RNA miało daleko idące konsekwencje – podobnie jak wcześniejsze prace teoretyczne K. Woese’a i pozwoliło nakreślić możliwy obraz ewolucji prebiotycznej na naszej planecie. Faktem jest, że od chwili odkrycia funkcji DNA jako nośnika informacji genetycznej dylemat, co pojawiło się wcześniej w toku ewolucji – DNA czy białko niezbędne do reprodukcji DNA – wydawał się niemal równie filozoficzny (czyli bezsensowny) jako pytanie o prymat wyglądu kury czy jajka. Po odkryciu T. Cheka rozwiązanie nabrało bardzo realnego kształtu - odkryto cząsteczkę, która miała właściwości zarówno nośnika informacji, jak i biokatalizatora (aczkolwiek w swojej szczątkowej formie). Z biegiem czasu badania te rozrosły się do całego kierunku w biologii, badającego pochodzenie życia przez pryzmat tzw. „świata RNA”.

Stało się więc oczywiste, że starożytny świat RNA można powiązać z pochodzeniem i rozkwitem życia pierwotnego. Nie wynika jednak automatycznie z tego, że RNA we współczesnych organizmach nie jest archaizmem dostosowanym do potrzeb wewnątrzkomórkowych układów molekularnych, ale naprawdę ważnym uczestnikiem molekularnego zespołu komórki. Dopiero rozwój metod molekularnych – w szczególności sekwencjonowania kwasów nukleinowych – pokazał, że RNA jest w komórce rzeczywiście niezastąpiony, i to nie tylko w postaci kanonicznej trójcy „mRNA, rRNA, tRNA”. Już pierwsze obszerne dane dotyczące sekwencjonowania DNA wskazywały na fakt, który początkowo wydawał się trudny do wyjaśnienia – większość z nich okazała się niekodujące- czyli nie niosący informacji o cząsteczkach białka lub „standardowym” RNA. Oczywiście można to częściowo przypisać „resztom genetycznym” – „wyłączonym” lub utraconym funkcjom fragmentów genomu. Jednak oszczędzanie takiej ilości „posagu” na systemy biologiczne, które starają się oszczędzać energię, wydaje się nielogiczne.

Rzeczywiście, bardziej szczegółowe i subtelne metody badawcze pozwoliły odkryć całą klasę RNA regulatorów ekspresji genów, częściowo wypełniających przestrzeń międzygenową. Jeszcze przed odczytaniem pełnych sekwencji genomów eukariotycznych glisty C. elegancja Wyizolowano mikroRNA – małe cząsteczki (około 20 nukleotydów), które mogą specyficznie wiązać się z regionami mRNA zgodnie z zasadą komplementarności. Łatwo się domyślić, że w takich przypadkach nie da się już odczytać informacji o zakodowanych białkach za pomocą mRNA: rybosom po prostu nie może „przebiec” przez takie miejsce, które nagle stało się dwuniciowe. Ten mechanizm tłumienia ekspresji genów, tzw Interferencja RNA, został już wystarczająco szczegółowo przeanalizowany na temat „biocząsteczki”. Do chwili obecnej odkryto tysiące cząsteczek mikroRNA i innych niekodujących RNA (piRNA, snoRNA, nanoRNA itp.). U eukariontów (w tym ludzi) znajdują się one w regionach międzygenowych. Ustalono ich ważną rolę w różnicowaniu komórek, karcynogenezie, odpowiedzi immunologicznej oraz innych procesach i patologiach.

Małe RNA są końmi trojańskimi dla białek bakteryjnych

Pomimo tego, że niekodujące białka RNA w bakteriach odkryto znacznie wcześniej niż pierwsze podobne regulatory u eukariontów, ich rola w metabolizmie komórki bakteryjnej była przez długi czas zawoalowana przez społeczność naukową. Jest to zrozumiałe – tradycyjnie komórkę bakteryjną uważano dla badacza za strukturę bardziej prymitywną i mniej tajemniczą, której złożoności nie da się porównać z nagromadzeniem struktur w komórce eukariotycznej. Ponadto w genomach bakteryjnych zawartość informacji niekodującej stanowi zaledwie kilka procent całkowitej długości DNA, a u niektórych prątków sięga maksymalnie 40%. Biorąc jednak pod uwagę, że mikroRNA występują nawet w wirusach, w bakteriach powinny one odgrywać ważną rolę regulacyjną, tym bardziej.

Okazało się, że prokarioty mają całkiem sporo małych regulatorów RNA. Tradycyjnie wszystkie można podzielić na dwie grupy:

1. Cząsteczki RNA, które muszą wiązać się z białkami, aby spełniać swoją funkcję.
2. RNA, które wiążą się komplementarnie z innymi RNA (zawierają większość znanych cząsteczek regulatorowych RNA).

Do pierwszej grupy zaliczają się małe RNA, dla których wiązanie z białkami jest możliwe, ale nie konieczne. Dobrze znanym przykładem jest RNaza P, która działa jak rybozym na „dojrzewającym” tRNA. Jeśli jednak RNaza P może funkcjonować bez składnika białkowego, to w przypadku innych małych RNA z tej grupy wiązanie z białkiem jest obowiązkowe (a one same są w rzeczywistości kofaktorami). Na przykład tmRNA aktywuje złożony kompleks białkowy, pełniąc rolę „klucza głównego” dla „zablokowanego” rybosomu – jeśli informacyjny RNA, z którego jest odczytywany, osiągnął swój koniec i nie natrafiono na kodon stop.

Znany jest również jeszcze bardziej intrygujący mechanizm bezpośredniego oddziaływania małych RNA z białkami. Białka wiążące się z „tradycyjnymi” kwasami nukleinowymi są szeroko rozpowszechnione w każdej komórce. Komórka prokariotyczna nie jest wyjątkiem. Na przykład jego białka histonopodobne pomagają prawidłowo upakować nić DNA, a specyficzne białka represorowe mają powinowactwo do regionu operatorowego genów bakteryjnych. Wykazano, że represory te mogą być hamowane przez małe RNA imitujące miejsca wiązania DNA „natywne” dla tych białek. Zatem na małym RNA CsrB (ryc. 1) znajduje się 18 miejsc „wabików”, które służą zapobieganiu dotarciu białka represora CsrA do jego prawdziwego celu – operonu glikogenu. Nawiasem mówiąc, wśród białek represorowych traconych pod wpływem tak małych RNA znajdują się regulatory globalnych szlaków metabolicznych, które umożliwiają wielokrotne wzmacnianie sygnału hamującego małego RNA. Robi to na przykład mały RNA 6S, który „imituje” współczynnik białkowy σ 70. Poprzez „oszustwo” konfiguracyjne, zajmując centra wiązania polimerazy RNA z czynnikiem sigma, zabrania ekspresji genów „uporządkowania”.

Rycina 1. Przewidywana bioinformatycznie struktura drugorzędowa małego RNA CsrB z Vibrio cholera M66-2. Małe RNA są cząsteczkami jednoniciowymi, ale podobnie jak inne RNA, składaniu się w stabilną strukturę przestrzenną towarzyszy tworzenie obszarów, w których cząsteczka hybrydyzuje ze sobą. Nazywa się liczne zagięcia konstrukcji w postaci otwartych pierścieni szpilki. W niektórych przypadkach kombinacja spinek do włosów pozwala RNA działać jak „gąbka”, niekowalencyjnie wiążąc określone białka. Częściej jednak cząsteczki tego typu zakłócają DNA lub RNA; w tym przypadku struktura przestrzenna małego RNA zostaje zakłócona i powstają nowe miejsca hybrydyzacji z cząsteczką docelową. Mapa cieplna odzwierciedla prawdopodobieństwo, że odpowiednia para nukleotydów zostanie faktycznie połączona wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem wodorowym; dla sekcji niesparowanych - prawdopodobieństwo utworzenia wiązań wodorowych z dowolnymi sekcjami wewnątrz cząsteczki. Obraz uzyskano za pomocą programu RNAfold.

Małe RNA bakterii zakłócają... i to bardzo skutecznie!

Mechanizm działania regulatorów drugiej grupy jest na ogół podobny do regulatorowego RNA u eukariontów – jest to ta sama interferencja RNA poprzez hybrydyzację z mRNA, tyle że same łańcuchy małych RNA są często dłuższe – nawet do kilkuset nukleotydy ( cm. Ryż. 1). W rezultacie, ze względu na mały RNA, rybosomy nie mogą odczytać informacji z mRNA. Choć często, jak się wydaje, do tego nie dochodzi: powstałe kompleksy „mały RNA – mRNA” stają się celem RNaz (takich jak RNaza P).

Zwartość i gęstość upakowania genomu prokariotycznego daje się odczuć: jeśli u eukariontów większość regulatorowych RNA jest zapisana w oddzielnych (najczęściej niekodujących białka) loci, wówczas wiele małych RNA bakterii można zakodować w tym samym regionie DNA, co tłumiony gen, ale na przeciwległych łańcuchach! Te RNA nazywane są kodowany w formacie cis(antysensowny) i małe RNA leżące w pewnej odległości od tłumionej części DNA - transkodowane. Najwyraźniej ułożenie cis-RNA można uznać za triumf ergonomii: można je odczytać z przeciwnej nici DNA w momencie jej rozwinięcia jednocześnie z docelowym transkryptem, co pozwala na precyzyjną kontrolę ilości syntetyzowanego białka.

Małe RNA w trans ewoluują niezależnie od docelowego mRNA, a sekwencja regulatora zmienia się silniej w wyniku mutacji. Być może taki układ jest korzystny tylko dla komórki bakteryjnej, ponieważ mały RNA nabiera aktywności przeciwko wcześniej niezwykłym celom, co zmniejsza czas i koszty energii potrzebne do tworzenia innych regulatorów. Z drugiej strony presja selekcyjna zapobiega nadmiernej mutacji trans małego RNA, ponieważ utraci on aktywność. Jednakże, aby hybrydyzować z informacyjnym RNA, większość trans-małych RNA wymaga elementu pomocniczego, białka Hfq. W przeciwnym razie niepełna komplementarność małego RNA może powodować problemy z wiązaniem z celem.

Najwyraźniej potencjalny mechanizm regulacyjny oparty na zasadzie „jeden mały RNA – wiele celów” pomaga zintegrować sieci metaboliczne bakterii, co jest niezwykle niezbędne w warunkach krótkiego życia pojedynczej komórki. Można kontynuować spekulacje na ten temat i założyć, że za pomocą transkodowanych małych RNA „instrukcje” ekspresyjne są wysyłane z funkcjonalnie powiązanych, ale fizycznie odległych loci. Potrzeba tego rodzaju genetycznego „apelu” logicznie wyjaśnia dużą liczbę małych RNA występujących w bakteriach chorobotwórczych. Na przykład kilkaset małych RNA znaleziono u rekordzisty tego wskaźnika - Vibrio cholerae ( Vibrio cholera). To mikroorganizm, który może przetrwać w otaczającym środowisku wodnym (zarówno świeżym, jak i słonym), a także na wodnych skorupiakach, rybach i jelitach człowieka - nie da się obejść bez kompleksowej adaptacji za pomocą cząsteczek regulatorowych!

CRISPR chroni zdrowie bakterii

Małe RNA wykorzystano także do rozwiązania innego palącego problemu bakterii. Nawet najbardziej złośliwe patogenne ziarniaki i prątki mogą być bezsilne w obliczu zagrożenia, jakie stwarzają specjalne wirusy - bakteriofagi, zdolne do błyskawicznego niszczenia populacji bakterii. Organizmy wielokomórkowe posiadają wyspecjalizowany system ochrony przed wirusami - odporny, za pomocą komórek i wydzielanych przez nie substancji, chroniąc organizm przed nieproszonymi gośćmi (w tym o charakterze wirusowym). Komórka bakteryjna jest samotnikiem, ale nie jest tak bezbronna, jak mogłoby się wydawać na pierwszy rzut oka. Loci pełnią rolę strażników receptur na utrzymanie przeciwwirusowej odporności bakterii CRISPR- skupione, regularnie przerywane krótkie powtórzenia palindromiczne ( skupione, regularnie przeplatane krótkimi powtórzeniami palindromowymi) (ryc. 2; ). W genomach prokariotycznych każda kaseta CRISPR jest reprezentowana przez sekwencję liderową o długości kilkuset nukleotydów, po której następuje seria 2–24 (czasami do 400) powtórzeń oddzielonych regionami rozdzielającymi o podobnej długości, ale unikalnej sekwencji nukleotydów. Długość każdego odstępnika i powtórzenia nie przekracza stu par zasad.

Rycina 2. Locus CRISPR i przetwarzanie odpowiadającego mu małego RNA w funkcjonalny transkrypt. W genomie CRISPR- kasetę reprezentują przeplatające się ze sobą przekładki (na rysunku są oznaczone jako Sp), częściowo homologiczny do regionów DNA faga i powtórzeń ( Przez) o długości 24–48 pz, co świadczy o symetrii diadycznej. W przeciwieństwie do powtórzeń, odstępniki w tym samym locus mają tę samą długość (u różnych bakterii może to być 20–70 nukleotydów), ale różnią się sekwencją nukleotydów. Sekcje „powtórzenia odstępu” mogą być dość długie i składać się z kilkuset jednostek. Cała struktura jest otoczona z jednej strony sekwencją liderów ( płyta długogrająca, kilkaset par zasad). Geny Cas znajdują się w pobliżu ( C RISPR-Jak powiązane), zorganizowane w operę. Odczytane z nich białka pełnią szereg funkcji pomocniczych, zapewniając obróbkę odczytanego transkryptu CRISPR-locus, jego udana hybrydyzacja z docelowym DNA faga, wstawienie nowych elementów do locus, itp. CrRNA powstały w wyniku wieloetapowej obróbki hybrydyzuje z odcinkiem DNA (dolna część rysunku) wstrzykniętym przez faga do bakterii. To wycisza maszynę transkrypcyjną wirusa i zatrzymuje jego reprodukcję w komórce prokariotycznej.

Szczegółowy mechanizm powstawania wszystkiego CRISPR-locus pozostaje do zbadania. Ale dzisiaj zaproponowano schematyczny diagram wyglądu przekładek, najważniejszych struktur w jego składzie. Okazuje się, że „łowców bakterii” bije ich własna broń – kwasy nukleinowe, a raczej „trofeum” informacji genetycznej otrzymanej przez bakterie od fagów w poprzednich bitwach! Faktem jest, że nie wszystkie fagi, które dostaną się do komórki bakteryjnej, okazują się śmiertelne. DNA takich fagów (prawdopodobnie sklasyfikowanych jako umiarkowane) jest cięty przez specjalne białka Cas (ich geny flankują CRISPR) na małe fragmenty. Niektóre z tych fragmentów zostaną osadzone w CRISPR- loci genomu „gospodarza”. A kiedy DNA faga ponownie dostanie się do komórki bakteryjnej, napotyka mały RNA CRISPR-locus, w tym momencie wyrażany i przetwarzany przez białka Cas. Następnie następuje inaktywacja informacji genetycznej wirusa, zgodnie z mechanizmem interferencji RNA opisanym już powyżej.

Z hipotezy tworzenia przekładek nie jest jasne, dlaczego potrzebne są między nimi powtórzenia, w obrębie jednego miejsca o nieco różnej długości, ale prawie identycznej sekwencji? Tutaj jest szerokie pole dla wyobraźni. Być może bez powtórzeń problematyczne byłoby podzielenie danych genetycznych na fragmenty semantyczne, przypominające sektory na dysku twardym komputera, a następnie dostęp maszyny transkrypcyjnej do ściśle określonych obszarów CRISPR-locus stałoby się trudne? A może powtórzenia upraszczają procesy rekombinacji po wstawieniu nowych elementów DNA faga? A może są to „znaki interpunkcyjne” niezbędne do przetwarzania CRISPR? Tak czy inaczej, w odpowiednim czasie zostanie odnaleziona biologiczna przyczyna wyjaśniająca zachowanie komórki bakteryjnej na wzór Pliuszkina Gogola.

CRISPR, będący „kroniką” związku bakterii z fagiem, może znaleźć zastosowanie w badaniach filogenetycznych. Zatem ostatnio przeprowadzono typowanie wg CRISPR pozwoliło nam przyjrzeć się ewolucji poszczególnych szczepów drobnoustroju dżumy ( Yersinia pestis). Zbadaj je CRISPR- „rodowody” rzuciły światło na wydarzenia sprzed pół tysiąca lat, kiedy szczepy przybyły do ​​Mongolii z terenów dzisiejszych Chin. Ale nie dla wszystkich bakterii, a w szczególności patogenów, Ta metoda odpowiedni. Pomimo niedawnych dowodów wskazujących na przewidywaną obróbkę białek CRISPR u patogenów tularemii ( Francisella tularensis) i cholerę, same CRISPR, jeśli są obecne w ich genomie, są nieliczne. Być może fagi, biorąc pod uwagę ich pozytywny wkład w nabywanie zjadliwości przez patogennych przedstawicieli królestwa bakterii, nie są na tyle szkodliwe i niebezpieczne, aby się przed nimi bronić za pomocą CRISPR? A może wirusy atakujące te bakterie są zbyt różnorodne i strategia „zakłócania” odporności na RNA przeciwko nim jest daremna?

Rysunek 3. Niektóre mechanizmy działania ryboprzełącznika. Ryboprzełączniki (ryboprzełączniki) są wbudowane w informacyjny RNA, ale wyróżniają się dużą swobodą zachowań konformacyjnych w zależności od konkretnych ligandów, co daje podstawy do uznania ryboprzełączników za niezależne jednostki małych RNA. Zmiana konformacji platformy ekspresyjnej wpływa na miejsce lądowania rybosomu w mRNA ( RBS), a w konsekwencji określa dostępność całego mRNA do odczytu. Ryboswitchy przypominają w pewnym stopniu domenę operatorską w modelu klasycznym gumilaka-operon - ale tylko regiony aptamerów są zwykle regulowane przez substancje niskocząsteczkowe i przełączają działanie genów na poziomie mRNA, a nie DNA. A - W przypadku braku ligandów, ryboprzełączniki btuB (transporter kobalaminy) I tiM (zależny od pirofosforanu tiaminy), które przeprowadzają nienukleolityczną represję mRNA, są „włączone” ( NA) i pozwalają rybosomowi zająć się swoimi sprawami. Wiązanie ligandu z ryboprzełącznikiem ( WYŁĄCZONY-pozycja) prowadzi do powstania spinki do włosów, czyniąc ten obszar niedostępnym dla rybosomu. B - Ryboprzełącznik lizynowy lysC w przypadku braku ligandu jest również uwzględniony ( NA). Wyłączenie przełącznika rybosomowego blokuje dostęp rybosomu do mRNA. Ale w przeciwieństwie do opisanych powyżej ryboprzełączników, w przełączniku lizynowym, po wyłączeniu, sekcja zostaje „odsłonięta”, przecięta specjalnym kompleksem RNazy ( degradosom) i cały mRNA jest wykorzystywany, rozkładając się na małe fragmenty. Represja przez ryboswitch w tym przypadku nazywana jest nukleolityczną ( nukleolityczny) i jest nieodwracalny, ponieważ w odróżnieniu od przykładu ( A ), przełączanie wsteczne (powrót do NA) nie jest już możliwe. Należy zauważyć, że w ten sposób można osiągnąć wykorzystanie grupy „niepotrzebnych” mRNA: ryboswitch przypomina część zestawu konstrukcyjnego dla dzieci, a cała grupa funkcjonalnie powiązanych cząsteczek matrix może mieć przełączniki o podobnej budowie Struktura.

Riboswitch - czujnik bakterii

Istnieją zatem małe RNA powiązane z białkami, małe RNA zakłócające własne mRNA bakterii, a także RNA wychwytywane przez bakterie z wirusów i tłumiące DNA faga. Czy można sobie wyobrazić inny mechanizm regulacji przy użyciu małych RNA? Okazuje się, że tak. Jeśli przeanalizujemy to, co opisano powyżej, odkryjemy, że we wszystkich przypadkach regulacji antysensownej, interferencję małego RNA z obiektem docelowym obserwuje się w wyniku hybrydyzacji dwóch indywidualny Cząsteczki. Dlaczego nie uporządkować małego RNA jako część samego transkrypcji? Wówczas możliwa jest zmiana konformacji takiego „zagubionego kozaka” wewnątrz mRNA, zmiana dostępności całego szablonu do odczytu podczas translacji lub, co jest jeszcze bardziej celowe energetycznie, regulacja biosyntezy mRNA, tj. transkrypcja!

Struktury takie są szeroko obecne w komórkach bakteryjnych i są znane jako ryboprzełączniki ( ryboprzełącznik). Znajdują się one przed początkiem części kodującej genu, na końcu 5' mRNA. Konwencjonalnie w składzie ryboprzełączników można wyróżnić dwa motywy strukturalne: region aptameru, odpowiedzialny za wiązanie z ligandem (efektorem) i platforma ekspresyjna, zapewniając regulację ekspresji genów poprzez przejście mRNA do alternatywnych struktur przestrzennych. Do działania służy np. taki wyłącznik (typu „wyłączony”) operon lizynowy: gdy lizyny jest nadmiar, występuje ona w postaci „splątanej” struktury przestrzennej uniemożliwiającej odczyt z operonu, a gdy jej brakuje, ryboprzełącznik „rozwija się” i białka niezbędne do biosyntezy syntetyzowana jest lizyna (ryc. 3).

Opisany schemat urządzenia ryboswitch nie jest kanoniczny, istnieją odmiany. U Vibrio cholerae odkryto ciekawy „włączający” tandemowy przełącznik rybosowy: platformę ekspresyjną poprzedza dwa na raz region aptameru. Zapewnia to oczywiście większą czułość i płynniejszą reakcję na pojawienie się w komórce innego aminokwasu – glicyny. Być może „podwójny” przełącznik ryboprzełącznikowy w genomie patogenu, podobny w zasadzie działania, pośrednio wpływa na wysoką przeżywalność bakterii wąglik (Bacillus anthracis). Reaguje ze związkiem wchodzącym w skład pożywki minimalnej i niezbędnym dla tego drobnoustroju – pirofosforanem tiaminy.

Oprócz przełączania szlaków metabolicznych w zależności od „menu” dostępnego komórce bakteryjnej, ryboswitchy mogą być czujnikami homeostazy bakteryjnej. Tym samym dostrzeżono je w regulacji dostępności genu do odczytu, gdy funkcjonowanie układu translacyjnego wewnątrz komórki zostaje zakłócone (np. sygnały takie jak pojawienie się „nienaładowanych” tRNA i „wadliwych” (zatrzymanych) rybosomów ) lub gdy zmieniają się czynniki środowiskowe (na przykład wzrost temperatury).

Nie potrzeba białek, daj nam RNA!

Co zatem oznacza obecność tak dużej różnorodności regulatorów małego RNA wewnątrz bakterii? Czy oznacza to odrzucenie koncepcji, w której głównymi „menedżerami” są białka, czy też mamy do czynienia z kolejnym trendem w modzie? Widocznie ani jedno, ani drugie. Oczywiście niektóre małe RNA są globalnymi regulatorami szlaków metabolicznych, jak np. wspomniany CsrB, który wraz z CsrC bierze udział w regulacji magazynowania węgla organicznego. Jednak biorąc pod uwagę zasadę duplikacji funkcji w układach biologicznych, małe RNA bakterii można bardziej porównać do „menedżera kryzysowego” niż do dyrektor generalny. Tym samym w warunkach gdzie dla przetrwania mikroorganizmu jest to konieczne szybko rekonfigurują metabolizm wewnątrzkomórkowy, ich rola regulacyjna może być decydująca i skuteczniejsza niż białka o podobnych funkcjach. Zatem regulatory RNA odpowiadają raczej za szybką reakcję, mniej stabilną i niezawodną niż w przypadku białek: nie powinniśmy zapominać, że mały RNA zachowuje swoją strukturę 3D i jest utrzymywany na hamowanej matrycy przez słabe wiązania wodorowe.

Pośrednim potwierdzeniem tych tez mogą być wspomniane już małe RNA Vibrio cholerae. Dla tej bakterii wejście do organizmu ludzkiego nie jest pożądanym celem, ale najwyraźniej sytuacją awaryjną. Produkcja toksyn i aktywacja innych szlaków związanych z zjadliwością jest w tym przypadku jedynie reakcją obronną na agresywną opozycję środowiska i komórek organizmu wobec „obcych”. „Zbawicielami” są tutaj małe RNA, na przykład Qrr, które pomagają vibrio w stresujących warunkach modyfikować jego strategię przetrwania, zmieniając zbiorowe zachowanie. Hipotezę tę można również pośrednio potwierdzić odkryciem małego RNA VrrA, które jest aktywnie syntetyzowane, gdy w organizmie znajdują się wibratory i hamuje wytwarzanie białek błonowych Omp. „Ukryte” białka błonowe w początkowej fazie infekcji mogą pomóc uniknąć silnej odpowiedzi immunologicznej organizmu człowieka (ryc. 4).

Rycina 4. Małe RNA w realizacji właściwości patogennych Vibrio cholerae. A - Vibrio cholerae czuje się dobrze i dobrze rozmnaża się w środowisku wodnym. Organizm ludzki prawdopodobnie nie jest główną niszą ekologiczną dla tego drobnoustroju. B - Po przedostaniu się drogą wodną lub pokarmową zakażenia do agresywnego środowiska - jelita cienkiego człowieka - wibracja pod względem zorganizowanego zachowania zaczyna przypominać pseudoorganizm, którego głównym zadaniem jest powstrzymywanie odpowiedzi immunologicznej i stworzyć sprzyjające środowisko do kolonizacji. Bardzo ważne Pęcherzyki błonowe odpowiadają za koordynację działań w populacji bakterii i ich interakcję z organizmem. Nie do końca poznane czynniki środowiskowe w jelicie działają jako sygnały ekspresji małych RNA (na przykład VrrA) w wibriosach. W efekcie zostaje uruchomiony mechanizm powstawania pęcherzyków, które przy małej liczbie komórek Vibrio w jelicie są nieimmunogenne. Oprócz opisanego efektu, małe RNA pomagają „ukryć” białka błonowe Omp, które są potencjalnie prowokacyjne dla układu odpornościowego człowieka. Przy pośrednim udziale małych RNA Qrr1-4 uruchamiana jest intensywna produkcja toksyny cholery (niepokazanej na rysunku), co uzupełnia zakres reakcji adaptacyjnych Vibrio cholerae. V - W ciągu kilku godzin kwota komórki bakteryjne wzrasta, a pula małych RNA VrrA maleje, co prawdopodobnie prowadzi do ekspozycji białek błonowych. Stopniowo zmniejsza się także liczba „pustych” pęcherzyków, które na tym etapie są zastępowane immunogennymi, dostarczanymi do enterocytów. Najwyraźniej jest to część „planu” wdrożenia złożonego sygnału, którego znaczeniem jest sprowokowanie ewakuacji wibracji z ludzkiego ciała. Uwaga: nie obserwuje się stosunku wielkości komórek bakteryjnych do enterocytów.

Ciekawie będzie zobaczyć, jak zmieni się nasze rozumienie regulatorów małego RNA, gdy zostaną uzyskane nowe dane na platformach RNAseq, w tym na temat form wolno żyjących i niehodowanych. Niedawne prace z wykorzystaniem „głębokiego sekwencjonowania” przyniosły już nieoczekiwane wyniki, wskazując na obecność cząsteczek podobnych do mikroRNA u zmutowanych paciorkowców. Oczywiście takie dane wymagają dokładnego sprawdzenia, ale tak czy inaczej, możemy śmiało powiedzieć, że badanie małych RNA w bakteriach przyniesie wiele niespodzianek.

Podziękowanie

Oryginalne pomysły i projekt kompozycyjny podczas tworzenia obrazu tytułowego, a także zdjęcia 4, należą do absolwenta Instytutu Archiologii Południowego Uniwersytetu Federalnego Kopaeva E.A. Obecność ryciny 2 w artykule jest zasługą profesora nadzwyczajnego katedry. Zoologia SFU G.B. Bachtadze. Dokonał także korekty naukowej i rewizji ryciny tytułowej oraz ryciny 4. Autor wyraża im głęboką wdzięczność za cierpliwość i twórcze podejście do sprawy. Specjalne podziękowania kieruję do mojego kolegi, starszego badacza. laboratorium. biochemia drobnoustrojów Rostowskiego Instytutu Przeciw zarazie Sorokin V.M. za dyskusję nad tekstem artykułu i podzielenie się cennymi uwagami.

Literatura

1. Carl Woese (1928–2012) ;;. 80 , 1148-1154;
2. R. R. Breaker. (2012). Ryboswitchy i świat RNA. Perspektywy Cold Spring Harbor w biologii. 4 , a003566-a003566;
3. J. Patrick Bardill, Brian K. Hammer. (2012). Niekodujące sRNA regulują zjadliwość patogenu bakteryjnego Vibrio cholerae. Biologia RNA. 9 , 392-401;
4. Heon-Jin Lee, Su-Hyung Hong. (2012). Analiza małych RNA o wielkości mikroRNA u Streptococcus mutans metodą głębokiego sekwencjonowania. FEMS Microbiol Lett. 326 , 131-136;
5. POSEŁ. Caron, L. Bastet, A. Lussier, M. Simoneau-Roy, E. Masse, DA Lafontaine. (2012). Przełącznik ryboswitchowy o podwójnym działaniu kontroluje inicjację translacji i rozpad mRNA. Postępowanie Narodowej Akademii Nauk. 109 , E3444-E3453.

Metafora leżąca u podstaw nazwy zjawiska interferencji RNA nawiązuje do eksperymentu z petunią, kiedy sztucznie wprowadzone do rośliny geny syntetazy pigmentu różowego i fioletowego nie zwiększały intensywności barwy, a wręcz przeciwnie, ją zmniejszały. Podobnie w przypadku „zwykłej” interferencji nałożenie dwóch fal może prowadzić do wzajemnego „zniesienia”.

W żywej komórce przepływ informacji między jądrem a cytoplazmą nigdy nie wysycha, jednak zrozumienie wszystkich jej „zawirowań” i rozszyfrowanie zakodowanej w niej informacji to naprawdę herkulesowe zadanie. Za jeden z najważniejszych przełomów w biologii ostatniego stulecia można uznać odkrycie informacyjnych (lub matrycowych) cząsteczek RNA (mRNA lub mRNA), które służą jako pośrednicy przenoszący „wiadomości” informacyjne z jądra (z chromosomów) do cytoplazmy . Decydującą rolę RNA w syntezie białek przewidziano już w 1939 r. w pracach Torbjörna Casperssona, Jeana Bracheta i Jacka Schultza, a w 1971 r. George Marbaix zapoczątkował syntezę hemoglobiny w oocytach żab poprzez wstrzyknięcie króliczego informacyjnego RNA kodującego to białko do pierwszy raz.

W latach 1956-57 w Związku Radzieckim A. N. Belozersky i A. S. Spirin niezależnie udowodnili istnienie mRNA, a także odkryli, że większość RNA w komórce to nie matryca, ale rybosomalny RNA (rRNA). Rybosomalny RNA, drugi „główny” typ RNA komórkowego, tworzy „szkielet” i centrum funkcjonalne rybosomów we wszystkich organizmach; To rRNA (a nie białka) reguluje główne etapy syntezy białek. Jednocześnie opisano i zbadano trzeci „główny” typ RNA - transferowe RNA (tRNA), które w połączeniu z dwoma innymi - mRNA i rRNA - tworzą pojedynczy kompleks syntetyzujący białko. Według dość popularnej hipotezy „świata RNA”, to właśnie ten kwas nukleinowy leżał u samych początków życia na Ziemi.

Dzięki temu, że RNA jest znacznie bardziej hydrofilowe w porównaniu do DNA (ze względu na zastąpienie dezoksyrybozy rybozą), jest bardziej labilne i może stosunkowo swobodnie przemieszczać się w komórce, dzięki czemu dostarcza krótkotrwałe repliki informacji genetycznej (mRNA) do miejsca, w którym rozpoczyna się synteza białek. Warto jednak zwrócić uwagę na związaną z tym „niedogodność” – RNA jest bardzo niestabilne. Jest przechowywany znacznie gorzej niż DNA (nawet wewnątrz komórki) i ulega degradacji przy najmniejszej zmianie warunków (temperatura, pH). Oprócz „własnej” niestabilności duży udział mają rybonukleazy (lub RNazy) – klasa enzymów rozszczepiających RNA, które są bardzo stabilne i „wszechobecne” – nawet skóra dłoni eksperymentatora zawiera wystarczającą ilość tych enzymów, aby zanegować cały eksperyment. Z tego powodu praca z RNA jest znacznie trudniejsza niż z białkami czy DNA – to ostatnie można na ogół przechowywać przez setki tysięcy lat praktycznie bez uszkodzeń.

Fantastyczna opieka podczas pracy, tridestylat, sterylne rękawiczki, jednorazowe szkło laboratoryjne – to wszystko było niezbędne, aby zapobiec degradacji RNA, jednak utrzymanie takich standardów nie zawsze było możliwe. Dlatego przez długi czas po prostu nie zwracali uwagi na krótkie „fragmenty” RNA, które nieuchronnie zanieczyszczały roztwory. Jednak z biegiem czasu stało się jasne, że pomimo wszelkich wysiłków zmierzających do utrzymania sterylności miejsca pracy, w naturalny sposób nadal odkrywane są „zanieczyszczenia”, a potem okazało się, że w cytoplazmie zawsze znajdują się tysiące krótkich dwuniciowych RNA , pełniąc bardzo specyficzne funkcje i są absolutnie niezbędne do prawidłowego rozwoju komórek i organizmu.

Zasada interferencji RNA

Obecnie badanie małych regulatorowych RNA jest jednym z najszybciej rozwijających się obszarów Biologia molekularna. Odkryto, że wszystkie krótkie RNA spełniają swoje funkcje w oparciu o zjawisko zwane interferencją RNA (istotą tego zjawiska jest tłumienie ekspresji genów na etapie transkrypcji lub translacji przy aktywnym udziale małych cząsteczek RNA). Mechanizm interferencji RNA pokazano bardzo schematycznie na ryc. 1:

Ryż. 1. Podstawy interferencji RNA
Cząsteczki dwuniciowego RNA (dsRNA) są rzadkością w normalnych komórkach, ale stanowią istotny etap w cyklu życiowym wielu wirusów. Specjalne białko zwane Dicer, po wykryciu dsRNA w komórce, „tnie” je na małe fragmenty. Nić antysensowna takiego fragmentu, który można już nazwać krótkim interferującym RNA (siRNA, od siRNA – small interferencyjny RNA), jest związana przez kompleks białek zwany RISC (ang. RNA-operative Silencing Complex), którego centralnym elementem jest endonukleaza z rodziny Argonaute. Wiązanie z siRNA aktywuje RISC i inicjuje poszukiwanie w komórce cząsteczek DNA i RNA, które są komplementarne do „wzorcowego” siRNA. Losem takich cząsteczek jest zniszczenie lub inaktywacja przez kompleks RISC.

Podsumowując, krótkie „cięcia” obcego (w tym celowo wprowadzonego) dwuniciowego RNA służą jako „szablon” do poszukiwania na dużą skalę i niszczenia komplementarnego mRNA (co jest równoznaczne z tłumieniem ekspresji odpowiedniego genu) nie tylko w jednej komórce, ale także w sąsiednich. Dla wielu organizmów - pierwotniaków, mięczaków, robaków, owadów, roślin - zjawisko to jest jednym z głównych sposobów obrony immunologicznej przed infekcjami.

W 2006 roku Andrew Fire i Craig Mello otrzymali Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny „za odkrycie zjawiska interferencji RNA – mechanizmu wyciszania genów z udziałem dsRNA”. Choć samo zjawisko interferencji RNA opisano już dawno (już na początku lat 80. XX w.), to dopiero prace Fire’a i Mello nakreśliły mechanizm regulacyjny małych RNA i nakreśliły nieznany dotąd obszar badań molekularnych. Oto główne rezultaty ich pracy:

• Podczas interferencji RNA rozszczepiane jest mRNA (a nie inne);
• Dwuniciowy RNA działa (powoduje rozszczepienie) znacznie skuteczniej niż jednoniciowy RNA. Te dwie obserwacje przewidywały istnienie wyspecjalizowanego układu pośredniczącego w działaniu dsRNA;
• dsRNA, komplementarny do odcinka dojrzałego mRNA, powoduje rozszczepienie tego ostatniego. Wskazywało to na cytoplazmatyczną lokalizację procesu i obecność specyficznej endonukleazy;
• Niewielka ilość dsRNA (kilka cząsteczek na komórkę) wystarczy, aby całkowicie „wyłączyć” gen docelowy, co wskazuje na istnienie kaskadowego mechanizmu katalizy i/lub amplifikacji.

Wyniki te położyły podwaliny pod cały obszar współczesnej biologii molekularnej – interferencję RNA – i na dziesięciolecia wyznaczyły wektor prac wielu grup badawczych na całym świecie. Do chwili obecnej odkryto trzy duże grupy małych RNA, które odgrywają w polu molekularnym rolę „zespołu interferującego RNA”. Poznajmy je bardziej szczegółowo.

Gracz nr 1 – krótki interferujący RNA

O specyfice interferencji RNA decyduje krótki interferujący RNA (siRNA) – małe dwuniciowe cząsteczki RNA o wyraźnie określonej strukturze (patrz ryc. 2).

siRNA są najwcześniejsze w ewolucji i są najbardziej rozpowszechnione w roślinach, organizmach jednokomórkowych i bezkręgowcach. U kręgowców praktycznie nie stwierdza się siRNA, ponieważ zostały one zastąpione późniejszymi „modelami” krótkich RNA (patrz poniżej).

siRNA – „szablony” do przeszukiwania cytoplazmy i niszczenia cząsteczek mRNA – mają długość 20–25 nukleotydów i „cechę szczególną”: 2 niesparowane nukleotydy na końcach 3’ i fosforylowane końce 5’. Antysensowny siRNA jest w stanie (oczywiście nie sam, ale przy pomocy kompleksu RISC) rozpoznać mRNA i specyficznie spowodować jego degradację: docelowy mRNA jest cięty dokładnie w miejscu komplementarnym do 10. i 11. nukleotydu antysensowny łańcuch siRNA.

Ryż. 2. Mechanizm „interferencji” pomiędzy mRNA i siRNA
„Interferujące” krótkie cząsteczki RNA mogą albo przedostać się do komórki z zewnątrz, albo zostać „wycięte” z dłuższego dwuniciowego RNA. Głównym białkiem wymaganym do cięcia dsRNA jest endonukleaza Dicer. „Wyłączenie” genu poprzez mechanizm interferencyjny odbywa się za pomocą siRNA wraz z kompleksem białkowym RISC, na który składają się trzy białka – endonukleaza Ago2 oraz dwa białka pomocnicze PACT i TRBP. Później odkryto, że kompleksy Dicer i RISC mogą wykorzystywać jako „nasiono” nie tylko dsRNA, ale także jednoniciowy RNA tworzący dwuniciową spinkę do włosów, a także gotowy siRNA (ten ostatni omija „cięcie” etapie i natychmiast wiąże się z RISC).

Funkcje siRNA w komórkach bezkręgowców są dość zróżnicowane. Pierwszą i najważniejszą rzeczą jest ochrona immunologiczna. „Tradycyjny” układ odpornościowy (limfocyty + leukocyty + makrofagi) występuje tylko w złożonych organizmach wielokomórkowych. U organizmów jednokomórkowych, bezkręgowców i roślin (które albo nie mają takiego systemu, albo jest on w powijakach) obrona immunologiczna opiera się na interferencji RNA. Odporność oparta na interferencji RNA nie wymaga skomplikowanych prekursorowych narządów „trenujących”. komórki odpornościowe(śledziona, grasica); jednocześnie różnorodność teoretycznie możliwych krótkich sekwencji RNA (421 wariantów) jest skorelowana z liczbą możliwych przeciwciał białkowych zwierząt wyższych. Ponadto siRNA syntetyzowane są na bazie „wrogiego” RNA, który zainfekował komórkę, co oznacza, że ​​w przeciwieństwie do przeciwciał są natychmiast „dopasowywane” do konkretnego rodzaju infekcji. I choć ochrona oparta na interferencji RNA nie działa poza komórką (przynajmniej nie ma jeszcze takich danych), to zapewnia odporność wewnątrzkomórkową bardziej niż zadowalająco.

Przede wszystkim siRNA tworzy odporność przeciwwirusową poprzez niszczenie mRNA lub genomowego RNA organizmów zakaźnych (tak np. odkryto siRNA w roślinach). Wprowadzenie wirusowego RNA powoduje silną amplifikację specyficznych siRNA w oparciu o cząsteczkę startera - sam wirusowy RNA. Ponadto siRNA tłumią ekspresję różnych ruchomych elementów genetycznych (MGE), a zatem zapewniają ochronę przed endogennymi „infekcjami”. Mutacje w genach kompleksu RISC często prowadzą do zwiększonej niestabilności genomu ze względu na wysoką aktywność MGE; siRNA może działać jako ogranicznik ekspresji własnych genów, uruchamiając się w odpowiedzi na ich nadekspresję. Regulacja funkcji genów może zachodzić nie tylko na poziomie translacji, ale także podczas transkrypcji – poprzez metylację genów na histonie H3.

We współczesnej biologii eksperymentalnej nie można przecenić znaczenia interferencji RNA i krótkich RNA. Opracowano technologię „wyłączania” (lub niszczenia) poszczególnych genów in vitro (na hodowlach komórkowych) i in vivo (na embrionach), co stało się już de facto standardem przy badaniu dowolnego genu. Czasem nawet w celu ustalenia roli poszczególnych genów w jakimś procesie systematycznie „wyłączają” wszystkie geny po kolei.

Możliwość wykorzystania siRNA zainteresowali się także farmaceuci, gdyż zdolność do specyficznej regulacji funkcjonowania poszczególnych genów stwarza niespotykane dotąd perspektywy w leczeniu wielu chorób. Mały rozmiar i duża specyficzność działania zapewniają wysoką skuteczność i niską toksyczność leków opartych na siRNA; Jednak nie udało się jeszcze rozwiązać problemu dostarczania siRNA do chorych komórek w organizmie - wynika to z kruchości i kruchości tych cząsteczek. I chociaż dziesiątki zespołów próbują obecnie znaleźć sposób na skierowanie tych „magicznych kul” dokładnie w cel (wewnątrz chorych narządów), nie osiągnęły one jeszcze widocznego sukcesu. Poza tym są inne trudności. Przykładowo w przypadku terapii przeciwwirusowej wysoka selektywność działania siRNA może wyrządzić krzywdę – skoro wirusy szybko mutują, zmodyfikowany szczep bardzo szybko straci wrażliwość na wybrany na początku terapii siRNA: wiadomo, że zastąpienie tylko jednego nukleotydu w siRNA prowadzi do znacznego zmniejszenia efektu interferencji.

W tym miejscu warto jeszcze raz przypomnieć – siRNA znaleziono jedynie u roślin, bezkręgowców i organizmów jednokomórkowych; Chociaż homologi białek do interferencji RNA (Dicer, kompleks RISC) są również obecne u zwierząt wyższych, siRNA nie zostały wykryte konwencjonalnymi metodami. Cóż za niespodzianka, gdy sztucznie wprowadzone syntetyczne analogi siRNA wywołały silny, specyficzny, zależny od dawki efekt w hodowlach komórkowych ssaków! Oznaczało to, że w komórkach kręgowców interferencja RNA nie została zastąpiona przez bardziej złożony układ odpornościowy, ale ewoluowała wraz z organizmami, przekształcając się w coś bardziej „zaawansowanego”. W związku z tym u ssaków konieczne było poszukiwanie nie dokładnych analogów siRNA, ale ich ewolucyjnych następców.

Gracz nr 2 – mikroRNA

Rzeczywiście, w oparciu o starożytny ewolucyjnie mechanizm interferencji RNA, bardziej rozwinięte organizmy rozwinęły dwa wyspecjalizowane systemy kontrolowania działania genów, każdy wykorzystujący własną grupę małych RNA - mikroRNA i piRNA (RNA oddziałujący z Piwi). Obydwa systemy pojawiły się w gąbkach i koelenteratach i wraz z nimi ewoluowały, wypierając siRNA i mechanizm interferencji „nagiego” RNA. Ich rola w zapewnianiu odporności maleje, gdyż funkcję tę przejmują bardziej zaawansowane mechanizmy odporności komórkowej, w szczególności układ interferonowy. Jednakże system ten jest na tyle czuły, że uruchamia także sam siRNA: pojawienie się małego dwuniciowego RNA w komórce ssaka wyzwala „sygnał alarmowy” (aktywuje wydzielanie interferonu i powoduje ekspresję genów zależnych od interferonu, co całkowicie blokuje wszystkie procesy tłumaczeniowe). Pod tym względem w mechanizmie interferencji RNA u zwierząt wyższych pośredniczą głównie mikroRNA i piRNA - jednoniciowe cząsteczki o specyficznej strukturze, które nie są wykrywane przez układ interferonu.

W miarę jak genom stawał się coraz bardziej złożony, mikroRNA i piRNA w coraz większym stopniu angażowały się w regulację transkrypcji i translacji. Z biegiem czasu zamieniły się w dodatkowy, precyzyjny i subtelny system regulacji genomu. W przeciwieństwie do siRNA, mikroRNA i piRNA (odkryte w 2001 r., patrz ryc. 3, A-B) nie są wytwarzane z obcych cząsteczek dwuniciowego RNA, ale są początkowo kodowane w genomie organizmu gospodarza.

Prekursor mikroRNA ulega transkrypcji z obu nici genomowego DNA przez polimerazę RNA II, co skutkuje pojawieniem się formy pośredniej – pri-microRNA – noszącej cechy zwykłego mRNA – czapeczki m7G i ogona poliA. Prekursor ten tworzy pętlę z dwoma jednoniciowymi „ogonami” i kilkoma niesparowanymi nukleotydami w środku (ryc. 3A). Taka pętla poddawana jest dwuetapowej obróbce (ryc. B): najpierw endonukleaza Drosha odcina jednoniciowe „ogony” RNA od spinki do włosów, po czym odcięty spinka do włosów (pre-microRNA) jest eksportowana do cytoplazmy, gdzie jest rozpoznawany przez Dicera, który wykonuje jeszcze dwa cięcia (wycinany jest odcinek dwuniciowy, oznaczony kolorami na ryc. 3A). W tej postaci dojrzały mikroRNA, podobnie jak siRNA, wchodzi w skład kompleksu RISC.

Mechanizm działania wielu mikroRNA jest podobny do działania siRNA: krótki (21–25 nukleotydów) jednoniciowy RNA będący częścią kompleksu białkowego RISC wiąże się z dużą swoistością z miejscem komplementarnym w nieulegającym translacji regionie 3' docelowy mRNA. Wiązanie prowadzi do rozszczepienia mRNA przez białko Ago. Jednak aktywność mikroRNA (w porównaniu z siRNA) jest już bardziej zróżnicowana – jeśli komplementarność nie jest absolutna, docelowy mRNA może nie ulec degradacji, a jedynie odwracalnie zablokowany (nie będzie translacji). Ten sam kompleks RISC może również wykorzystywać sztucznie wprowadzone siRNA. To wyjaśnia, dlaczego siRNA utworzone przez analogię z pierwotniakami są również aktywne u ssaków.

W ten sposób możemy uzupełnić ilustrację mechanizmu działania interferencji RNA w organizmach wyższych (dwustronnie symetrycznych), łącząc na jednym rysunku diagram działania mikroRNA i siRNA wprowadzonych biotechnologicznie (ryc. 3B).

Ryż. 3A: Struktura dwuniciowej cząsteczki prekursora mikroRNA
Główne cechy: obecność konserwatywnych sekwencji tworzących spinkę do włosów; obecność kopii komplementarnej (microRNA*) z dwoma „dodatkowymi” nukleotydami na końcu 3’; specyficzna sekwencja (2–8 pz), która tworzy miejsce rozpoznawane przez endonukleazy. Sam mikroRNA jest podświetlony na czerwono — to właśnie wycina Dicer.

Ryż. 3B: Ogólny mechanizm Przetwarzanie mikroRNA i realizacja jego działania

Ryż. 3B: Uogólniony schemat działania sztucznych mikroRNA i siRNA
Sztuczne siRNA wprowadza się do komórki za pomocą wyspecjalizowanych plazmidów (wektor ukierunkowany na siRNA).

Funkcje mikroRNA

Funkcje fizjologiczne mikroRNA są niezwykle zróżnicowane - w rzeczywistości pełnią one rolę głównych niebiałkowych regulatorów ontogenezy. mikroRNA nie znoszą, ale uzupełniają „klasyczny” schemat regulacji genów (induktory, supresory, zagęszczenie chromatyny itp.). Ponadto synteza samych mikroRNA jest kompleksowo regulowana (niektóre pule mikroRNA mogą być włączane przez interferony, interleukiny, czynnik martwicy nowotworu α (TNF-α) i wiele innych cytokin). W efekcie powstaje wielopoziomowa sieć strojenia „orkiestry” tysięcy genów, zadziwiającej swoją złożonością i elastycznością, ale na tym się nie kończy.

mikroRNA są bardziej „uniwersalne” niż siRNA: geny „oddziałowe” nie muszą być w 100% komplementarne – regulacja odbywa się również poprzez częściową interakcję. Obecnie jednym z najgorętszych tematów w biologii molekularnej jest poszukiwanie mikroRNA, które pełnią rolę alternatywnych regulatorów znanych procesów fizjologicznych. Na przykład opisano już mikroRNA zaangażowane w regulację cyklu komórkowego i apoptozę u roślin, Drosophila i nicieni; u ludzi mikroRNA regulują układ odpornościowy i rozwój krwiotwórczych komórek macierzystych. Zastosowanie technologii opartych na biochipach (przesiewowe mikromacierze) pokazało, że całe pule małych RNA są włączane i wyłączane na różnych etapach życia komórki. Dla procesów biologicznych zidentyfikowano dziesiątki specyficznych mikroRNA, których poziom ekspresji w określonych warunkach zmienia się tysiące razy, co podkreśla wyjątkową sterowalność tych procesów.

Do niedawna uważano, że mikroRNA jedynie tłumią – całkowicie lub częściowo – pracę genów. Niedawno okazało się jednak, że działanie mikroRNA może się radykalnie różnić w zależności od stanu komórki! W aktywnie dzielącej się komórce mikroRNA wiąże się z komplementarną sekwencją w regionie 3' mRNA i hamuje syntezę białek (translację). Jednak w stanie spoczynku lub stresu (na przykład podczas uprawy w złym środowisku) to samo zdarzenie prowadzi do dokładnie odwrotnego efektu - zwiększonej syntezy docelowego białka!

Ewolucja mikroRNA

Liczba odmian mikroRNA w organizmach wyższych nie została jeszcze w pełni ustalona, ​​według niektórych danych przekracza 1% liczby genów kodujących białka (u człowieka np. mówią, że jest ich 700 i jest to liczba stale rośnie). mikroRNA regulują aktywność około 30% wszystkich genów (dla wielu z nich cele nie są jeszcze znane), a istnieją cząsteczki zarówno wszechobecne, jak i specyficzne tkankowo - na przykład jedna z takich ważnych puli mikroRNA reguluje dojrzewanie pnia krwi komórki.

Szeroki profil ekspresji w różnych tkankach różnych organizmów i biologiczne występowanie mikroRNA wskazują na starożytne ewolucyjne pochodzenie. MikroRNA odkryto po raz pierwszy u nicieni i przez długi czas uważano, że cząsteczki te występują jedynie w gąbkach i koelenteratach; jednakże odkryto je później w algach jednokomórkowych. Co ciekawe, w miarę jak organizmy stają się coraz bardziej złożone, wzrasta również liczba i niejednorodność puli miRNA. Pośrednio wskazuje to, że złożoność tych organizmów zapewnia w szczególności funkcjonowanie mikroRNA. Możliwą ewolucję miRNA pokazano na ryc. 4.

Ryż. 4. Różnorodność mikroRNA w różnych organizmach
Im wyższa organizacja organizmu, tym więcej znajduje się w nim mikroRNA (liczba w nawiasach). Gatunki, u których znaleziono pojedyncze mikroRNA, zaznaczono na czerwono. Według .

Można wyciągnąć wyraźne powiązanie ewolucyjne pomiędzy siRNA i mikroRNA w oparciu o następujące fakty:

• działanie obu typów jest wymienne i pośredniczą w nim białka homologiczne;
• siRNA wprowadzone do komórek ssaków specyficznie „wyłączają” pożądane geny (pomimo pewnej aktywacji ochrony interferonem);
• MikroRNA odkrywa się w coraz starszych organizmach.

Te i inne dane sugerują pochodzenie obu systemów od wspólnego „przodka”. Warto również zauważyć, że odporność „RNA” jako niezależny prekursor przeciwciał białkowych potwierdza teorię pochodzenia pierwszych form życia opartą na RNA, a nie na białkach (przypomnijmy, że jest to ulubiona teoria akademika A.S. Spirina) .

Chociaż na arenie biologii molekularnej było tylko dwóch „graczy” – siRNA i mikroRNA – główny „cel” interferencji RNA wydawał się całkowicie jasny. Rzeczywiście: zestaw homologicznych krótkich RNA i białek w różnych organizmach wykonuje podobne działania; W miarę jak organizmy stają się coraz bardziej złożone, wzrasta także funkcjonalność.

Jednak w procesie ewolucji natura stworzyła inny, ewolucyjnie najnowszy i wysoce wyspecjalizowany system oparty na tej samej skutecznej zasadzie interferencji RNA. Mówimy o piRNA (piRNA, z RNA interakcji Piwi).

Im bardziej złożony jest genom, tym bardziej rozwinięty i przystosowany jest organizm (lub odwrotnie? ;-). Jednak rosnąca złożoność genomu ma również wadę: złożony system genetyczny staje się niestabilny. Prowadzi to do konieczności istnienia mechanizmów odpowiedzialnych za utrzymanie integralności genomu – w przeciwnym razie spontaniczne „mieszanie” DNA po prostu go unieruchomi. Ruchome elementy genetyczne (MGE), jeden z głównych czynników niestabilności genomu, to krótkie, niestabilne regiony, które mogą ulegać autonomicznej transkrypcji i migrować w całym genomie. Aktywacja takich elementów transpozycyjnych prowadzi do wielokrotnych pęknięć DNA w chromosomach, co może mieć śmiertelne konsekwencje.

Liczba MGE rośnie nieliniowo wraz z rozmiarem genomu, a ich aktywność musi być ograniczona. Aby to zrobić, zwierzęta, zaczynając od koelenteratów, wykorzystują to samo zjawisko interferencji RNA. Tę funkcję pełnią także krótkie RNA, ale nie te, które już omawialiśmy, ale ich trzeci rodzaj – piRNA.

„Portret” piRNA

piRNA to krótkie cząsteczki o długości 24–30 nukleotydów, kodowane w regionach centromerowych i telomerowych chromosomu. Sekwencje wielu z nich są komplementarne do znanych ruchomych elementów genetycznych, ale istnieje wiele innych piRNA, które pokrywają się z regionami działających genów lub z fragmentami genomu, których funkcje są nieznane.

piRNA (a także mikroRNA) są kodowane w obu niciach genomowego DNA; są bardzo zmienne i różnorodne (nawet 500 000 (!) gatunków w jednym organizmie). W przeciwieństwie do siRNA i mikroRNA, są one utworzone przez jeden łańcuch cecha charakterystyczna– uracyl (U) na końcu 5’ i metylowany koniec 3’. Istnieją inne różnice:

• W przeciwieństwie do siRNA i mikroRNA nie wymagają one przetwarzania przez Dicer;
• Geny piRNA są aktywne tylko w komórkach rozrodczych (podczas embriogenezy) i otaczających je komórkach śródbłonka;
• Skład białek układu piRNA jest różny – są to endonukleazy klasy Piwi (Piwi i Aub) oraz osobna odmiana Argonaute – Ago3.

Przetwarzanie i aktywność piRNA są nadal słabo poznane, ale już wiadomo, że mechanizm działania jest zupełnie inny niż w przypadku innych krótkich RNA – dziś zaproponowano ping-pongowy model ich działania (ryc. 5 A, B).

Mechanizm ping-ponga biogenezy piRNA

Ryż. 5A: Cytoplazmatyczna część przetwarzania piRNA
W biogenezie i aktywności piRNA pośredniczy rodzina endonukleaz Piwi (Ago3, Aub, Piwi). Aktywność piRNA zapewniają zarówno jednoniciowe cząsteczki piRNA – sensowne, jak i antysensowne – z których każda wiąże się ze specyficzną endonukleazą Piwi. piRNA rozpoznaje komplementarny region mRNA transpozonu (niebieska nić) i wycina go. To nie tylko inaktywuje transpozon, ale także tworzy nowy piRNA (połączony z Ago3 poprzez metylację końca 3' przez metylazę Hen1). Ten piRNA z kolei rozpoznaje mRNA z transkryptami z klastra prekursorowego piRNA (nić czerwona) - w ten sposób cykl zostaje zamknięty i ponownie wytwarzany jest pożądany piRNA.

Ryż. 5B: piRNA w jądrze
Oprócz endonukleazy Aub, endonukleaza Piwi może również wiązać antysensowny piRNA. Po związaniu kompleks migruje do jądra, gdzie powoduje degradację komplementarnych transkryptów i przegrupowanie chromatyny, powodując supresję aktywności transpozonów.

Funkcje piRNA

Główną funkcją piRNA jest tłumienie aktywności MGE na poziomie transkrypcji i translacji. Uważa się, że piRNA są aktywne jedynie w okresie embriogenezy, kiedy nieprzewidywalne przetasowanie genomu jest szczególnie niebezpieczne i może doprowadzić do śmierci zarodka. To logiczne – kiedy układ odpornościowy jeszcze nie zaczął działać, komórki zarodka potrzebują prostej, ale skutecznej ochrony. Zarodek jest niezawodnie chroniony przed zewnętrznymi patogenami przez łożysko (lub skorupę jaja). Ale oprócz tego konieczna jest także obrona przed wirusami endogennymi (wewnętrznymi), przede wszystkim MGE.

Ta rola piRNA została potwierdzona doświadczeniem – „knockout”, czyli mutacje genów Ago3, Piwi czy Aub prowadzą do poważnych zaburzeń rozwojowych (i gwałtownego wzrostu liczby mutacji w genomie takiego organizmu), a także powodują niepłodność z powodu zakłócenia rozwoju komórek rozrodczych.

Dystrybucja i ewolucja piRNA

Pierwsze piRNA znaleziono już w ukwiałach i gąbkach. Rośliny najwyraźniej poszły inną drogą – nie znaleziono w nich białek Piwi, a rolę „kagańca” dla transpozonów pełni endonukleaza Ago4 i siRNA.

U zwierząt wyższych, w tym u ludzi, system piRNA jest bardzo dobrze rozwinięty, ale można go znaleźć tylko w komórkach embrionalnych i śródbłonku owodniowym. Czas pokaże, dlaczego dystrybucja piRNA w organizmie jest tak ograniczona. Można założyć, że jak każda potężna broń, piRNA przynoszą korzyść tylko w bardzo specyficznych warunkach (podczas rozwoju płodu), a w dorosłym organizmie ich działanie przyniesie więcej szkody niż pożytku. Mimo to liczba piRNA przewyższa liczbę znanych białek o rząd wielkości, a niespecyficzne działanie piRNA w dojrzałych komórkach jest trudne do przewidzenia.

Wniosek

Podsumowując, chciałbym przedstawić tabelę ilustrującą ewolucję aparatu białkowego biorącego udział w interferencji RNA (ryc. 6). Można zauważyć, że pierwotniaki mają najbardziej rozwinięty system siRNA (rodziny białek Ago, Dicer), a w miarę jak organizmy stają się bardziej złożone, nacisk przesuwa się na układy bardziej wyspecjalizowane – liczbę izoform białek dla mikroRNA (Drosha, Pasha) i piRNA ( Piwi, Hen1) wzrasta. Jednocześnie zmniejsza się różnorodność enzymów pośredniczących w działaniu siRNA.

Ryż. 6. Różnorodność białek biorących udział w interferencji RNA I
Liczby wskazują liczbę białek w każdej grupie. Elementy charakterystyczne dla siRNA i mikroRNA zaznaczono na niebiesko, a białka związane z piRNA na czerwono. Według .

Zjawisko interferencji RNA zaczęły wykorzystywać najprostsze organizmy. W oparciu o ten mechanizm natura stworzyła prototyp układu odpornościowego, a w miarę jak organizmy stają się coraz bardziej złożone, interferencja RNA staje się niezbędnym regulatorem aktywności genomu. Dwa różne mechanizmy plus trzy typy krótkich RNA (patrz tabela podsumowująca) – w rezultacie widzimy tysiące drobnych regulatorów różnych szlaków metabolicznych i genetycznych. Ten uderzający obraz ilustruje wszechstronność i ewolucyjną adaptację systemów biologii molekularnej. Krótkie RNA po raz kolejny udowadniają, że we wnętrzu komórki nie ma „małych rzeczy” – są jedynie małe cząsteczki, których pełne znaczenie dopiero zaczynamy rozumieć.

To prawda, że ​​tak fantastyczna złożoność sugeruje raczej, że ewolucja jest „ślepa” i działa bez z góry zatwierdzonego „ plan główny» .

Literatura

1. Gurdon J. B., Lane CD, Woodland HR, Marbaix G. (1971). Zastosowanie żabich jaj i oocytów do badania informacyjnego RNA i jego translacji w żywych komórkach. Natura 233, 177-182;
2. Spirin AS (2001). Biosynteza białek, świat RNA i pochodzenie życia. Biuletyn Rosyjskiej Akademii Nauk 71, 320-328;
3. Elementy: „Z sierści można teraz wyodrębnić kompletne genomy mitochondrialne wymarłych zwierząt”;
4. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. (1998). Silna i specyficzna interferencja genetyczna ze strony dwuniciowego RNA Caenorhabditis eleganckie. Natura 391, 806-311;
5. Biomolekuła: „MikroRNA odkryte po raz pierwszy w organizmie jednokomórkowym”;
6. Covey S., Al-Kaff N., Lángara A., Turner D. (1997). Rośliny zwalczają infekcję poprzez wyciszanie genów. Natura 385, 781-782;
7. Biomolekuła: „Podwójne działanie molekularne: ludzkie geny działają na rzecz wirusa grypy”;
8. Ren B. (2010). Transkrypcja: Wzmacniacze tworzą niekodujący RNA. Natura 465, 173–174;
9. Taganov K.D., Boldin MP, Chang K.J., Baltimore D. (2006). Zależna od NF-κB indukcja mikroRNA miR-146, inhibitora ukierunkowanego na białka sygnalizacyjne wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Proc. Natl. Acad. Nauka. USA. 103, 12481-12486;
10. O'Connell R. M., Rao D. S., Chaudhuri A. A., Boldin MP, Taganov K. D., Nicoll J., Paquette R. L., Baltimore D. (2008). Długotrwała ekspresja mikroRNA-155 w hematopoetycznych komórkach macierzystych powoduje zaburzenie mieloproliferacyjne. J. Exp. Med. 205, 585-594;
11. Biomolekuła: „mikroRNA – im dalej w las, tym więcej drewna na opał”;
12. Elementy: „Powikłania w organizmie starożytnych zwierząt wiązały się z pojawieniem się nowych cząsteczek regulacyjnych”;
13. Grimson A., Srivastava M., Fahey B., Woodcroft B.J., Chiang H.R., King N., Degnan B.M., Rokhsar D.S., Bartel D.P. (2008). Wczesne pochodzenie i ewolucja mikroRNA i RNA oddziałujących z Piwi u zwierząt. Natura 455, 1193–1197.
14. Aravin A., Hannon G., Brennecke J. (2007). Ścieżka Piwi-piRNA zapewnia obronę adaptacyjną w wyścigu zbrojeń transpozonowych. Nauka 318, 761–764;
15. Biocząsteczka: "

Długość siRNA wynosi 21-25 pz, powstają one z dsRNA. Źródłem takich RNA mogą być infekcje wirusowe, konstrukty genetyczne wprowadzone do genomu, długie spinki do włosów w transkryptach i dwukierunkowa transkrypcja elementów mobilnych.
dsRNA tnie się za pomocą RNase Dicer na fragmenty o długości 21-25 bp. z 3" końcami wystającymi 2 nukleotydów, po czym jeden z łańcuchów jest częścią RISC i kieruje cięciem homologicznych RNA. RISC zawiera siRNA odpowiadające zarówno plusowi, jak i obwody minusowe dsRNA. siRNA nie mają własnych genów i są fragmentami dłuższych RNA. siRNA kierują cięciem docelowego RNA, ponieważ są z nim całkowicie komplementarne. U roślin, grzybów i nicieni w procesie tłumienia ekspresji genów biorą udział polimerazy RNA zależne od RNA, dla których siRNA służą również jako startery (nasiona do syntezy nowego RNA). Powstały dsRNA jest cięty przez Dicer i powstają nowe siRNA, które są wtórne. W ten sposób sygnał jest wzmacniany.

Interferencja RNA

W 1998 roku Craig C. Mello i Andrew Fire opublikowali w Nature artykuł, w którym stwierdzili, że dwuniciowy RNA (dsRNA) jest zdolny do tłumienia ekspresji genów. Później okazało się, że substancją czynną w tym procesie jest krótki jednoniciowy RNA. Nazywa się mechanizm supresji ekspresji genów za pomocą tych RNA
Interferencja RNA, a także wyciszanie RNA. Mechanizm ten występuje we wszystkich dużych taksonach eukariontów: kręgowcach i bezkręgowcach, roślinach i grzybach. Za to odkrycie otrzymał w 2006 roku Nagrodę Nobla.
Tłumienie ekspresji może nastąpić na poziomie transkrypcji lub potranskrypcji. Okazało się, że we wszystkich przypadkach wymagany jest podobny zestaw białek i krótkie (21-32 pz) RNA.
siRNA regulują aktywność genów na dwa sposoby. Jak wspomniano powyżej, kierują one cięciem docelowych RNA. Zjawisko to nazywa się „stłumieniem” ( tłumienie) w grzybach, „ potranslacyjne wyciszanie genów„w roślinach i” Interferencja RNA "u zwierząt. W procesach tych biorą udział siRNA o długości 21-23 bp. Innym rodzajem efektu jest to, że siRNA może hamować transkrypcję genów zawierających homologiczne sekwencje siRNA. Zjawisko to nazwano wyciszanie genów transkrypcji (TGS) i występuje w drożdżach, roślinach i zwierzętach. siRNA kierują także metylacją DNA, co prowadzi do tworzenia heterochromatyny i represji transkrypcji. TGS najlepiej bada się w drożdżach S. pombe, gdzie stwierdzono, że siRNA są zintegrowane z kompleksem białkowym podobnym do RISC zwanym RITS. W jego przypadku, podobnie jak w przypadku RISC, siRNA oddziałuje z białkiem z rodziny AGO. Jest prawdopodobne, że siRNA jest w stanie skierować ten kompleks do genu zawierającego homologiczny fragment siRNA. Następnie białka RITS rekrutują metylotransferazy, w wyniku czego w locus kodującym docelowy gen siRNA powstaje heterochromatyna i aktywna ekspresja genu ustaje.

Rola w procesach komórkowych

Jakie jest znaczenie siRNA w komórce?
siRNA biorą udział w ochronie komórek przed wirusami, represji transgenów, regulacji niektórych genów i tworzeniu centromerowej heterochromatyny. Ważną funkcją siRNA jest tłumienie ekspresji ruchomych elementów genetycznych. Taka supresja może zachodzić zarówno na poziomie transkrypcyjnym, jak i potranskrypcyjnym.
Genom niektórych wirusów składa się z DNA, innych z RNA, a RNA wirusów może być jedno- lub dwuniciowe. Proces cięcia obcego (wirusowego) mRNA przebiega w tym przypadku w sposób opisany powyżej, czyli poprzez aktywację kompleksu enzymatycznego RISC. Jednak dla większej wydajności rośliny i owady wymyśliły unikalny sposób na wzmocnienie ochronnego działania siRNA. Łącząc nić mRNA, odcinek siRNA może przy pomocy kompleksu enzymatycznego DICER najpierw uzupełnić drugą nić mRNA, a następnie przeciąć ją w różnych miejscach, tworząc w ten sposób różnorodne „wtórne” siRNA. Te z kolei tworzą RISC i przenoszą mRNA przez wszystkie omówione powyżej etapy, aż do jego całkowitego zniszczenia. Takie cząsteczki „wtórne” będą mogły specyficznie wiązać się nie tylko z częścią wirusowego mRNA, na którą skierowana była cząsteczka „pierwotna”, ale także z innymi obszarami, co radykalnie zwiększa skuteczność obrony komórkowej.

Zatem w roślinach i niższych organizmach zwierzęcych siRNA stanowią ważną część pewnego rodzaju „odporności wewnątrzkomórkowej”, która pozwala im rozpoznać i szybko zniszczyć obcy RNA. Jeśli do komórki dostanie się RNA zawierający wirusa, taki system ochrony zapobiegnie jego namnażaniu. Jeśli wirus zawiera DNA, system siRNA zapobiegnie wytwarzaniu białek wirusowych (ponieważ niezbędne do tego mRNA zostanie rozpoznane i wycięte), a zastosowanie tej strategii spowolni jego rozprzestrzenianie się po organizmie.

Ssaki, w przeciwieństwie do owadów i roślin, mają inny system obronny. Kiedy obcy RNA, którego długość przekracza 30 bp, dostanie się do „dojrzałej” (zróżnicowanej) komórki ssaka, komórka ta zaczyna syntetyzować interferon. Interferon, wiążąc się ze specyficznymi receptorami na powierzchni komórki, jest w stanie pobudzić całą grupę genów w komórce. W rezultacie w komórce syntetyzowanych jest kilka rodzajów enzymów, które hamują syntezę białek i rozkładają wirusowe RNA. Ponadto interferon może działać także na sąsiednie, jeszcze niezainfekowane komórki, blokując w ten sposób ewentualne rozprzestrzenianie się wirusa.

Jak widać oba systemy są pod wieloma względami podobne: mają wspólny cel i „metody” pracy. Nawet nazwy „interferon” i „interferencja (RNA)” mają wspólne korzenie. Ale mają też jedną bardzo istotną różnicę: jeśli interferon przy pierwszych oznakach inwazji po prostu „zamraża” pracę komórki, nie pozwalając (na wszelki wypadek) na produkcję wielu, w tym „niewinnych” białek w komórce, wtedy system siRNA jest wyjątkowo zrozumiały: każdy siRNA rozpozna i zniszczy tylko swój własny, specyficzny mRNA. Zastąpienie tylko jednego nukleotydu w siRNA prowadzi do gwałtownego zmniejszenia efektu interferencji . Żaden ze znanych dotychczas blokerów genów nie posiada tak wyjątkowej specyficzności wobec swojego genu docelowego.

Odkrycie interferencji RNA dało nową nadzieję w walce z AIDS i nowotworami. Możliwe jest, że stosując terapię siRNA w połączeniu z tradycyjną terapią przeciwwirusową, można osiągnąć efekt wzmocnienia, w którym obie terapie dają większy efekt terapeutyczny niż zwykła suma każdego leczenia podawanego osobno.
Aby wykorzystać mechanizm interferencji siRNA w komórkach ssaków, należy wprowadzić do komórek gotowe dwuniciowe cząsteczki siRNA. Optymalny rozmiar taki syntetyczny siRNA ma te same 21-28 nukleotydów. Jeśli zwiększysz jego długość, komórki zareagują produkcją interferonu i zmniejszeniem syntezy białek. Syntetyczne siRNA mogą przedostawać się zarówno do komórek zakażonych, jak i zdrowych, a zmniejszenie produkcji białka w komórkach niezainfekowanych byłoby wysoce niepożądane. Z drugiej strony, jeśli spróbujesz użyć siRNA mniejszego niż 21 nukleotydów, specyficzność jego wiązania z pożądanym mRNA i zdolność do tworzenia kompleksu RISC gwałtownie spadają.

Jeśli możliwe jest dostarczenie siRNA w taki czy inny sposób, który ma zdolność wiązania się z dowolną częścią genomu HIV (który, jak wiadomo, składa się z RNA), można spróbować zapobiec jego integracji z DNA gospodarza komórka. Ponadto naukowcy opracowują sposoby wpływania na różne etapy reprodukcji wirusa HIV w już zakażonej komórce. To drugie podejście nie zapewni lekarstwa, ale może znacznie zmniejszyć tempo replikacji wirusa i pozwolić ludziom zostać osaczonym. układ odpornościowy szansa na „odpoczęcie” od ataku wirusa i samodzielne podjęcie próby uporania się z pozostałościami choroby. Na rysunku czerwonymi krzyżykami zaznaczono dwa etapy reprodukcji wirusa HIV w komórce, które, jak mają nadzieję naukowcy, można zablokować za pomocą siRNA (etapy 4-5 – integracja wirusa z chromosomem oraz etapy 5-6 – składanie wirusa i wyjście z komórki).


Dziś jednak wszystko to dotyczy wyłącznie dziedziny teorii. W praktyce terapia siRNA napotyka trudności, których naukowcom nie udało się dotychczas pokonać. Przykładowo w przypadku terapii przeciwwirusowej to właśnie wysoka specyficzność siRNA może płatać okrutny żart: jak wiadomo wirusy mają zdolność do szybkiej mutacji, tj. zmienić skład swoich nukleotydów. Szczególny sukces odniósł wirus HIV, którego częstotliwość zmian jest taka, że ​​u osoby zakażonej jednym podtypem wirusa po kilku latach może rozwinąć się zupełnie inny podtyp. W takim przypadku zmodyfikowany szczep HIV automatycznie stanie się niewrażliwy na wybrany na początku terapii siRNA.

Starzenie się i karcynogeneza

Jak każdy czynnik epigenetyczny, siRNA wpływają na ekspresję genów, które są wyciszone. Obecnie pojawiają się prace opisujące eksperymenty dotyczące wyłączania genów związanych z nowotworami. Geny są wyłączane (knock-down) za pomocą siRNA. Na przykład chińscy naukowcy wykorzystali siRNA do wyłączenia genu czynnika transkrypcyjnego 4 (TCF4), którego aktywność powoduje zespół Pitta-Hopkinsa (bardzo rzadką chorobę genetyczną charakteryzującą się upośledzeniem umysłowym oraz epizodami hiperwentylacji i bezdechu) i inne choroby psychiczne. W tej pracy badaliśmy rolę TCF4 w komórkach raka żołądka. Ektopowa ekspresja TCF4 zmniejsza wzrost komórek w liniach komórkowych raka żołądka, a wybicie genu TCF4 przy użyciu siRNA zwiększa migrację komórek. Można zatem stwierdzić, że epigenetyczne wyłączenie (wyciszenie) genu TCF4 odgrywa ważną rolę w powstawaniu i rozwoju nowotworów.

Jak wynika z badań Kliniki Onkologii Albert Einstein Cancer Center, kierowanych przez Leonarda H. Augenlichta, siRNA bierze udział w wyłączaniu genu HDAC4, który powoduje hamowanie wzrostu raka jelita grubego, apoptozę i zwiększoną transkrypcję p21. HDAC4 to deacetylaza histonowa, która jest specyficzna dla tkanki, hamuje różnicowanie komórek, a jej ekspresja jest tłumiona podczas procesu różnicowania komórek. Z pracy wynika, że ​​HDAC4 jest ważnym regulatorem proliferacji komórek jelita grubego (co jest istotne w procesie nowotworowym), a ten z kolei jest regulowany przez siRNA.

Katedra Patologii Uniwersytetu Medycznego Nara w Japonii przeprowadziła badania nad rakiem prostaty. Replikacyjne starzenie się komórek stanowi barierę przed niekontrolowanym podziałem i karcynogenezą. Krótko żyjące komórki dzielące (TAC) stanowią część populacji komórek prostaty, z której powstają nowotwory. Japońscy naukowcy badali powody, dla których komórki te pokonują proces starzenia. Komórki prostaty w hodowli transfekowano siRNA junB. W tych komórkach jest to obserwowane podwyższony poziom ekspresja p53, p21, p16 i pRb wykrywana podczas starzenia. W następnym etapie wykorzystano komórki w hodowli, które wykazywały obniżony poziom p16. Powtarzana transfekcja siRNA do TAC pozwoliła komórkom uniknąć starzenia się po inaktywacji p16/pRb. Ponadto wyciszenie protoonkogenu junB przez siRNA junB powoduje inwazję komórek. Na tej podstawie stwierdzono, że junB jest elementem p16 i sprzyja starzeniu się komórek, zapobiegając nowotworowi TAC. Zatem junB jest regulatorem karcynogenezy prostaty i może być celem interwencji terapeutycznej. A jego aktywność można regulować za pomocą siRNA.

Prowadzonych jest wiele podobnych badań. Obecnie siRNA to nie tylko przedmiot, ale także narzędzie w rękach badacza – lekarza, biologa, onkologa, gerontologa. Badanie związku między siRNA i nowotworem oraz ekspresją genów związanych z wiekiem jest najważniejszym zadaniem nauki. Od odkrycia siRNA minęło niewiele czasu, a pojawiło się wiele ciekawych badań i publikacji na ich temat. Nie ma wątpliwości, że ich badania będą jednym z kroków ludzkości w kierunku zwycięstwa nad rakiem i starzeniem się…

Małe RNA tworzące spinki do włosów lub krótkie RNA tworzące spinki do włosów (shRNA krótki RNA o strukturze spinki do włosów, mały RNA o strukturze spinki do włosów) cząsteczki krótkich RNA tworzące struktura wtórna obcisłe szpilki. ShRNA można wykorzystać do wyłączenia ekspresji... ... Wikipedia

Polimeraza RNA- z komórki T. aquaticus podczas replikacji. Niektóre elementy enzymu stają się przezroczyste, a łańcuchy RNA i DNA są wyraźniej widoczne. Jon magnezu (żółty) znajduje się w miejscu aktywnym enzymu. Polimeraza RNA to enzym, który wykonuje ... ... Wikipedia

Interferencja RNA- Dostarczanie małych RNA zawierających spinki do włosów za pomocą wektora na bazie lentiwirusa i mechanizm interferencji RNA w komórkach ssaków Interferencja RNA (a... Wikipedia

Gen RNA- Niekodujący RNA (ncRNA) to cząsteczki RNA, które nie ulegają translacji na białka. Poprzednio używany synonim, małe RNA (smRNA, małe RNA), nie jest już używany, ponieważ niektóre niekodujące RNA mogą być bardzo ... ... Wikipedia

Małe jądrowe RNA- (snRNA, snRNA) klasa RNA występująca w jądrze komórek eukariotycznych. Są transkrybowane przez polimerazę RNA II lub polimerazę RNA III i biorą udział w ważne procesy, takie jak splicing (usuwanie intronów z niedojrzałego mRNA), regulacja… Wikipedia

Małe jąderkowe RNA- (snoRNA, ang. snoRNA) klasa małych RNA biorących udział w modyfikacjach chemicznych (metylacja i pseudourydylacja) rybosomalnego RNA, a także tRNA i małego jądrowego RNA. Według klasyfikacji MeSH małe jąderkowe RNA uznawane są za podgrupę... ...Wikipedia

małe jądrowe (jądrowe o niskiej masie cząsteczkowej) RNA- Rozległa grupa (105 106) małych jądrowych RNA (100 300 nukleotydów), związanych z heterogenicznym jądrowym RNA, jest częścią małych granulek rybonukleoproteinowych jądra; M.n.RNA są niezbędnym składnikiem systemu splicingu... ...

małe cytoplazmatyczne RNA- Małe (100-300 nukleotydów) cząsteczki RNA zlokalizowane w cytoplazmie, podobne do małego jądrowego RNA. [Arefyev V.A., Lisovenko L.A. Angielsko-rosyjski słownik objaśniający terminy genetyczne 1995 407 s.] Tematy genetyka EN scyrpssmall cytoplasmic... ... Przewodnik tłumacza technicznego

małe jądrowe RNA klasy U- Grupa związanych z białkami małych (od 60 do 400 nukleotydów) cząsteczek RNA, które stanowią znaczną część zawartości spplikomu i biorą udział w procesie wycinania intronów; w 4 z 5 dobrze zbadanych typów Usn, RNA U1, U2, U4 i U5 to 5... ... Przewodnik tłumacza technicznego

Biomarkery RNA- * Biomarkery RNA * Biomarkery RNA to ogromna liczba ludzkich transkryptów, które nie kodują syntezy białek (nsbRNA lub npcRNA). W większości przypadków małe (miRNA, snoRNA) i długie (antysensowne RNA, dsRNA i inne typy) cząsteczki RNA to... ... Genetyka. słownik encyklopedyczny

Książki

• Kup za 1877 UAH (tylko Ukraina)
• Genetyka kliniczna. Podręcznik (+CD), Bochkov Nikolay Pavlovich, Puzyrev Valery Pavlovich, Smirnikhina Svetlana Anatolyevna. Wszystkie rozdziały zostały poprawione i uzupełnione w miarę rozwoju sytuacji nauki medyczne i ćwiczyć. Rozdziały poświęcone chorobom wieloczynnikowym, profilaktyce, leczeniu chorób dziedzicznych,…