При приготовлении питательных сред необходимо учитывать потребность культивируемых микроорганизмов в различных элементах питания. Существует различные классификации питательных сред.

Классификация питательных сред по составу:

1. Простые среды (МПБ, МПА, желатин, пептонная вода). Мясо-пептонный бульон (МПБ) является белковой основой всех сред.

Существует несколько способов приготовления МПБ:

а) на мясной воде с добавлением готового пептона;

б) на переварах продуктов гидролиза исходного сырья при помощи ферментов.

Мясо-пептонный агар (МПА) — получают путем добавления агар-агара (1,5-3%) к МПБ. Если МПА распределен по диагонали пробирки или флакона — это скошенный агар. Если среда распределена в пробирке вертикально высотой 5-7 см, это агар столбиком. МПА, застывший в чашках Петри в виде штастшки — пластинчатый агар. Если среда имеет вертикальный слой высотой 2-3 см, и диагональный слой такой же величины, это полускошенный агар.

2. Сложные среды готовятся на основе простых с определенными добавками (углеводы, кровь, желчь, яйца, сыворотка, молоко, соли, факторы роста и т.п.)

Классификация питательных сред по исходным компонентам:

1. Естественные питательные среды — это натуральный продукт животного или растительного происхождения.

Могут быть:

Растительные (исходные продукты — соя, горох, картофель, морковь и т.п.).

Животные (исходные продукты — мясо, рыба, яйца, молоко, животные ткани, желчь, сыворотка крови и т.п.).

Смешанные (МПА, среда Левенштейна - Йенсена и т.п.).

2. Искусственные среды содержат переработанные естественные продукты (мясную воду, перевар), вещества, полученные из этих продуктов (пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты) и различные добавки. Это самая большая и разнообразная по составу наиболее часто применяемая группа сред. Их готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ.

3. Синтетические среды (известного химического состава) состоят из химически чистых соединений в точно установленных концентрациях (с добавлением углеводов, солей, аминокислот, витаминов и т.п.). На основе этих сред, добавляя к ним естественные или искусственные среды, получают полусинтетические среды.

Классификация питательных сред по консистенции: среды бывают жидкие (среды без агара), полужидкие (с агаром до 1%), плотные (агаровые — 1,5-2,5%). Жидкие среды чаще применяют для изучения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы и продуктов обмена. Полужидкие среды обычно используют для хранения культур, плотные — для выделения микроорганизмов, изучения морфологии колоний, диагностических целей, количественного учета, определения антагонистических свойств и др.

Классификация питательных сред по целевому назначению: универсальные (общеупотребительные) и специальные.

Универсальные (основные) среды. Эти среды используют для культивирования большинства относительно неприхотливых микроорганизмов или применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и другие ингредиенты, необходимые для размножения того или иного вида микроорганизмов. К этой группе относятся: МПБ — мясо-пептонный бульон, МПА — мясо-пептонный агар, МПЖ — мясо-пептонный желатин и т.п.

Специальные среды. Предназначены для выделения и избирательного культивирования определенных видов микроорганизмов, которые не растут на простых средах.

Различают следующие виды специальных сред: среды обогащения, элективные, дифференциально-диагностические, консервирующие и среды накопления.

Среды обогащения. Многие микроорганизмы не растут на обычных средах, поэтому для повышения питательной ценности среды в нее добавляют углеводы (сахарный бульон или агар) или белки (сывороточный агар и бульон, кровяной агар и бульон). Кровяной агар или кровяной бульон — получают путем добавления к питательной среде 5-10% подогретой стерильной дефибринированной крови барана, кролика, лошади, человека. Среда используется для выделения стрептококков, пневмококков и других бактерий, а также для изучения гемолитической активности. Сывороточный бульон или сывороточный агар получают, путем добавления к простым средам 15-20% лошадиной или бычьей сыворотки.

2. Элективные (избирательные) среды. Эти среды предназначены для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида из материала, содержащего несколько видов микробов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микроорганизмов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого данная среда будет элективной. Избирательность среды достигается путем создания условий, оптимальных для культивирования определенных микробов (рН, Еh, концентрация солей, состав питательных веществ), т.е. положительной селекцией. Или путем добавления в среду веществ, угнетающих другие микроорганизмы (желчь, высокие концентрации NаС1, антибиотики и др.), т.е. отрицательной селекцией. К этой группе относятся:

Селенитовая среда — является лучшей средой обогащения для сальмонелл и дизентерийных микробов Зонне. Селенит натрия, содержащийся в среде, стимулирует рост этих бактерий и подавляет рост сопутствующей флоры.

Висмут-сульфит агар — содержит соли висмута, бриллиантовую зелень. Сальмонеллы растут на этой среде в виде колоний черного цвета. Другие виды бактерий на этой среде роста не дают.

Желточно-солевой агар (ЖСА) — среда для выделения стафилококков, содержит до 10% хлорида натрия, что подавляет большинство бактерий, содержащихся в материале. Кроме того, эта среда является и дифференциально-диагностической, так как присутствие яичного желтка позволяет выявить фермент лецитиназу (лецитовителлазу), который образуют патогенные стафилококки. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфорхолины и нерастворимые в воде жирные кислоты, поэтому среда вокруг лецитиназоположительных колоний мутнеет и появляется опалесцирующая зона в виде «радужного венчика».

Желчный бульон элективен для сальмонелл, размножение которых стимулирует добавленная 10% желчь, одновременно тормозящая рост сопутствующих микроорганизмов.

Щелочной агар или щелочная пептонная вода элективны для холерных вибрионов, щелочная реакция среды (рН 9,0) не препятствует росту холерных вибрионов, но тормозит рост других микроорганизмов. 3-5 сут. Ж

3. Дифференциально-диагностические среды. Дифференциально-диагностические среды применяют для дифференцировки одного вида микроорганизмов от другого по характеру их ферментативной активности. Состав этих сред подбирают с таким расчетом, чтобы четко выявить наиболее характерные свойства определенного вида микроорганизмов, основываясь на особенностях его обмена веществ.

Среды для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе белковые вещества: кровь, молоко, желатин и т.п. Наиболее распространенными средами являются мясо-пептонный желатин (МПЖ) свернувшаясялошадиная сыворотка, молоко и кровяной агар (КА).

Среды для изучения гликолитических свойств включают три основных компонента: питательная основа (бульон, агар), субстрат (моно- и дисахара, многоатомные спирты) и индикатор для выявления соответствующих ферментов. Ферментативное расщепление субстратов приводит к сдвигу рН и изменению окраски среды. Наиболее распространены цветные среды с различными углеводами (например, с бромтимоловым синим, индикатором ВР). Также широко распространены среды Гисса, на которых учитывают различия в способности ферментировать различные углеводы с образованием кислоты, либо кислоты и газа.

Для дифференцировки энтеробактерий применяют пептонную воду с набором различных углеводов, индикатором Андреде и поплавками, облегчающими обнаружение газообразования и помогающие визуально определить изменение рН, характерное для различных микроорганизмов. В частности, сдвиг в кислую сторону вызывает покраснение среды с реактивом Андреде или пожелтение при использовании среды с бромтимоловым синим, тогда как при защелачивании индикатор Андреде и бромтимоловый синий не меняют цвет среды. Например, для выделения патогенных бактерий из кишечника применяют среды, которые позволяют дифференцировать патогенные микроорганизмы от постоянных обитателей кишечника — микроорганизмов, разлагающих лактозу.

Такой средой является среда Эндо. Основными компонентами среды Эндо являются МПА, лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом натрия. Исходная питательная среда окрашена в светло-розовый цвет. При сбраживании лактозы образуется ацетальдегид, который реагирует с сульфитом и, высвободившийся при этом, фуксин окрашивает колонии в ярко-красный цвет. Поэтому кишечная палочка, которая сбраживает лактозу, при росте на этой среде образует красные колонии с металлическим блеском, а сальмонеллы и шигеллы — бесцветные, так как они не сбраживают лактозу .

4. Среды накопления, на которых происходит быстрый рост определенных видов микроорганизмов.

5. Консервирующие (транспортные) среды. Предназначены для сохранения микроорганизмов во время транспортировки к месту исследования. Эти среды, содержат добавки, предупреждающие размножение и гибель микробов, что способствует сохранению их жизнеспособности. Наибольшее применение нашли глицериновая смесь (среда Тига), фосфатно-буферная смесь и среды Кари-Блэйра, Амиеса (с активированным углем и без активированного угля), Стюарта и др.

Стерилизация питательных сред.

Все питательные среды независимо от их назначения разливают в чистую посуду и стерилизуют. Большинство сред стерилизуют автоклавированием, но при различных режимах в зависимости от их состава.

1. Синтетические среды и все агаровые среды, не содержащие в своем составе нативного белка и углеводов, стерилизуют 15-20 мин в автоклаве при температуре 115-120°С и давлении 1-1,5 атмосферы .

2. Среды с углеводами и молоком (в состав которого входит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100°С дробно или в автоклаве при 112°С и при давлении до 1 атмосферы.

3. Среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови, асцитическая жидкость), обеспложиваются тиндализацией или фильтрованием.

4. Для стерилизации питательных сред, содержащих в своем составе нативные белки, пользуются фильтрацией через мембранные фильтры Зейтца.

Для контроля стерильности среды после стерилизации помещают в термостат при 37°С на 3-5 сут. Жидкие среды должны оставаться прозрачными, а на поверхности и в толще плотных питательных сред не должны появляться признаки роста. Кроме контроля стерильности, про-изводят химический контроль готовых сред, который заключается в том, что в нескольких об-разцах каждой серии определяют рН, количество общего и аминного азота и хлоридов.

Существует также биологический контроль сред. В этом случае несколько образцов среды засевают лабораторной культурой того микроба, для которого приготовлена среда, и изучают характер его роста. Только после того, как среды выдержали контроль, их можно использовать по назначению.

Питательные среды классифицируют в зависимости от исходных компонентов, консистенции, целевого назначения, химического состава.

В зависимости от химического состава и исходных компонен­тов различают следующие типы питательных сред.

Среды неопределенного химического состава. Их подразделяют на: 1) среды животного происхождения (исходные продукты - мясо, рыба, яйца, молоко и т.д.); 2) среды растительного проис­хождения (исходные продукты - соя, горох, картофель, морковь и т.д.).

Некоторые продукты используют в натуральном виде (карто­фель, морковь, молоко и т. д.), но чаще животные и раститель­ные ткани подвергают различной обработке (экстрагированию, ферментативному или кислотному гидролизу).

Среды известного химического состава (синтетические). В них входят известные химические соединения (соли, углеводы, амино­кислоты, витамины и т. д.) в оптимальном количественном соот­ношении. Синтетические питательные среды используют, когда выращиваемую клеточную массу необходимо максимально осво­бодить от балластных органических соединений, входящих в со­став обычных сред, например при получении диагностических ал­лергенов или при изучении метаболических потребностей микро­организма в том или ином конкретном химическом соединении.

По консистенции питательные среды дифференцируют на плотные, полужидкие и жидкие.

Жидкие питательные среды. Готовят, используя экстракты, гидролизаты, растворы исходных продуктов.

Полужидкие и плотные питательные среды . Необходимую кон­систенцию среде придают добавлением различных уплотнителей.

Агар-агар (малайское желе) - полисахарид, продукт пе­реработки некоторых морских водорослей. Плавится при 80...86 ºС, затвердевает при 40 ºС. Для получения плотных сред его добавляют в количестве 1,5...2%, реже 3 %; полужидких - 0,3...0,7%.

Желатина - экстракт из тканей, содержащих много кол­лагена (кости, хрящи, сухожилия и т.д.). Желатиновый гель пла­вится при 25 °С, что делает его неудобным для выращивания микроорганизмов с температурным оптимумом 37...38 °С. Кроме того, ряд бактерий выделяют протеолитические ферменты, раз­лагающие желатину. Обычно в питательные среды вносят 10...20 % желатины.

По целевому назначению различают общеупотребительные (ос­новные), обогащенные, специальные, элективные (избиратель­ные) и дифференциально-диагностические питательные среды.

Общеупотребительные (основные) среды . Их применяют для культивирования относительно неприхотливых микроорганиз­мов.

В качестве исходных компонентов для приготовления основ­ных сред используют наиболее часто мясную воду, перевар Хоттингера, растительные гидролизаты.

Мясная вода: говядину освобождают от костей, жира, сухожилий, пропускают через мясорубку. Мясной фарш залива­ют водопроводной водой в соотношении 1: 2, кипятят 1 ч. После кипячения мясную воду охлаждают, фильтруют через ватно-мар-левый фильтр, затем доливают водопроводной водой до первона­чального объема, разливают по емкостям, закрывают ватно-мар-левыми пробками и стерилизуют при 120 °С 20 мин.

Перевар Хоттингера готовят из мясных отходов пу­тем их триптического гидролиза. Жир, фасции, сухожилия мелко нарезают, заливают кипящей водой в соотношении 1:2, кипятят, охлаждают до 45 °С и добавляют панкреатин, подщелачивают ра­створом карбоната натрия до рН 7,8...8,0, встряхивают и добавля­ют хлороформ (10 мл/л), плотно закрывают, выдерживают в теп­лом месте 10 дней, получают продукт гидролиза (перевар).

Мясо-пептонный бульон (МПБ). К 1 л мясной воды добавляют 1 % пептона и 0,5 % хлорида натрия, устанавли-

Рис. 32. Приготовление скошенного агара

вают необходимый рН дробным добавлением 10%-го раствора гидроксида натрия или гидроксида калия. Фильтруют через бу­мажный фильтр, разливают по колбам, пробиркам и стерилизуют при 120 "С 15...20 мин.

Мясо-пептонный агар (МПА): к МПБ добавляют 2...3 % промытого мелко нарезанного агар-агара, нагревают до расплавления агара, доводят до кипения, в горячем виде прове­ряют рН, затем, если необходимо, доводят его до нужного значе­ния (7,2...7,6), фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Про­фильтрованный горячий агар разливают по пробиркам и колбам, стерилизуют автоклавированием при 1 атм 20...30 мин. Чтобы по­лучить скошенную поверхность агара, удобную для посева, после стерилизации пробирки с расплавленным МПА оставляют при комнатной температуре до уплотнения в наклонном положении (конец с пробкой приподнят) (рис. 32).

Широко используют культивирование микроорганизмов на плотных питательных средах в чашках Петри. Диаметр стандарт­ной чашки Петри (рис. 33) около 10 см, выпускают чашки мень­шего и большего диаметров, а также одноразовые пластиковые. В

стандартные стерильные чашки Петри над пламенем горелки на­ливают около 20 мл расплавленного и охлажденного до 45...50 "С питательного агара, чашки помещают на горизонтальную по­верхность до застывания агара.

Полужидкий мясо-пептонный агар (ПЖА) готовят, как МПА, но добавляют 0,25 % агара. Кипятят при по­мешивании до полного расплавления агара, устанавливают рН 7,2...7,6, фильтруют в горячем виде, стерилизуют в автоклаве.

Мясо-пептонная желатина (МПЖ): к МПБ до­бавляют 10...20% измельченной желатины, нагревают до рас­плавления уплотнителя, устанавливают рН 7,2...7,4, кипятят, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по пробир­кам и стерилизуют дробно в аппарате Коха три дня по 20 мин или однократно в автоклаве при 112°С 15 мин.

Бульон Хоттингера: основной перевар Хоттингера разводят водопроводной водой в соотношении 1:5 (1:8) до со­держания аминного азота 120 мг%, добавляют 0,5% хлорида на­трия, 0,1 г гидрофосфата калия, устанавливают рН 7,4...7,6, кипя­тят 15...20 мин, фильтруют через ватно-марлевый или бумажный фильтр, разливают по емкостям и стерилизуют при 120 °С 20...30 мин.

Агар Хоттингера готовят, добавляя к бульону Хот­тингера 2 % агар-агара.

Предприятия биологической промышленности выпускают го­товые питательные бульон и агар в виде сухого порошка.

Питательный бульон содержит (г/л): триптический гидролизат кильки - 10,05, хлорид натрия - 4,95. Навеску по­рошка массой 15 г растворяют в 1 л дистиллированной воды, ки­пятят 2 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по емкостям и стерилизуют в автоклаве при 120 ºС 20 мин (рН 7,3).

Питательный агар содержит (г/л): ферментативный гидролизат кормовых дрожжей - 12,0; агар- 12,5; хлорид на­трия - 5,5. Навеску порошка массой 36 г растворяют в 1 л дис­тиллированной воды, кипятят 3 мин, фильтруют через ватный фильтр, стерилизуют при 120 "С 20 мин (рН 7,3).

Обогащенные среды. Многие виды болезнетворных бактерий плохо растут на общеупотребительных питательных средах, по­этому в основные среды добавляют кровь, сыворотку крови, уг­леводы и т. д. Такие питательные среды получили название обо­гащенных.

Сывороточный и кровяной агары: к рас­плавленному и охлажденному до 45...50°С стерильному пита­тельному агару добавляют 5...10% стерильной дефибринирован-ной крови барана (кролика) или сыворотки крови (лошади, круп­ного рогатого скота, кролика). Для получения дефибринирован-ной крови у барана кровь берут асептично из яремной вены стерильной иглой в стерильный флакон (или колбочку) со стек­лянными (фарфоровыми) бусами или шариками, встряхивают вращательными движениями 15...20 мин, чтобы предотвратить свертывание крови. Фибрин остается на бусах.

Компоненты перемешивают, разливают в чашки Петри, про­бирки и оставляют до застывания питательной среды.

Сывороточный и кровяной бульоны гото­вят аналогичным образом.

Растворы углеводов (глюкоза и др.) стерилизуют текучим паром или фильтрованием и добавляют в количестве 0,5... 1 % к питательной среде.

Специальные среды . Так называют среды, разработанные с уче­том специфических ростовых потребностей ряда бактерий. На­пример, желточная среда Мак-Коя для возбудителя туляремии, среда Терских для культивирования лептоспир и др.

Среда Мак-Коя: чистые куриные яйца обрабатывают спиртом, быстро проводят через пламя горелки. Стерильно вскрывают, желтки отделяют от белков. К 60 частям желтков добавляют 40 частей физиологического раствора (рН 7,0...7,2). Компоненты перемешивают, разливают в пробирки по 4...5 мл и помещают в наклонном положении в аппарат для свертыва­ния сыворотки. Стерилизуют в первый день при 75 °С 1 ч, на второй день при 85 °С 30 мин. Для контроля стерильности при­готовленные среды выдерживают 2 сут в термостате при 37...38 °С.

Среда Терских состоит из фосфатной смеси Зеренсе-на и кроличьей сыворотки. Смесь Зеренсена: раствор А: гидро­фосфат натрия - 11,876 г, вода дистиллированная - 1000 мл; ра­створ Б: дигидрофосфат калия - 9,078 г, вода дистиллирован­ная - 1000 мл. К 90 мл раствора А добавляют 10 мл раствора Б и доводят объем дистиллированной водой до 1000 мл. Раствор раз­ливают в пробирки по 5 мл, стерилизуют при 1,5 атм 20 мин. В каждую пробирку добавляют шесть-восемь капель стерильной инактивированной при 56 °С сыворотки кролика.

Элективные среды (лат. electus - избранный). Это питательные
среды для избирательного выделения и накопления микроорганизмов определенного вида из материалов, содержащих несколько видов микробов. Элективные среды чрезвычайно многообразны по своему составу. В них включают компоненты, обеспечивающие преимущественный рост искомого микроорганизма и
(или) подавляющие в той или иной степени рост сопутствующей
микрофлоры. По консистенции среды данного типа могут быть
плотными и жидкими. Жидкие элективные среды называют средами обогащения или накопления, их применяют, когда ставят

цель увеличить количество искомого микроорганизма в смешанной популяции.

Молочно-солевой агар предназначен для избирательного культивирования стафилококков. К расплавленному МПА с рН 7,2...7,4, содержащему 5...7,5 % хлорида натрия, до­бавляют 10 % стерильного обезжиренного молока, перемешива­ют и разливают в чашки Петри.

Среда Шустовой предназначена для выделения саль­монелл. Представляет собой МПА (рН 7,4) с добавлением 10 % к объему среды 50%-го водного раствора тиосульфата натрия и 2 % раствора Люголя.

Среда Раппопорт предназначена для культивирова­ния сальмонелл. К МПБ добавляют 1 % глюкозы, 10 % желчи, 1 % индикатора Андрэдэ. Стерилизуют текучим паром.

Среда Мюллера предназначена для культивирования сальмонелл. В колбу с 4,5 г стерильного мела наливают 90 мл МПБ, стерилизуют в автоклаве при 120 "С 30 мин. Затем стериль­но добавляют 2 мл раствора Люголя и 10 мл раствора тиосульфата натрия (тиосульфат натрия - 50 г, дистиллированная вода - 100 мл), стерилизуют в аппарате Коха 30 мин.

Среда Кауфмана - это среда обогащения для сальмо­нелл. К 100 мл среды Мюллера добавляют 1 мл водного раствора бриллиантового зеленого, разведенного 1: 1000, и 5 мл стериль­ной бычьей желчи. Смесь стерилизуют текучим паром 30 мин.

Казеиново-угольный агар (КУА) с пеницилли­ном используют для культивирования бордетелл. К 1000 мл дис­тиллированной воды добавляют гидролизат казеина - 20 мл, хлорид натрия - 5 г, хлорид калия - 0,2 г, хлорид кальция - 0,002 г, карбонат натрия - 0,4 г, хлорид магния - 0,025 г, гидро­фосфат калия - 0,24 г, растворимый крахмал - 1 г, цистин - 0,01 г, агар -20 г. Компоненты растворяют, устанавливают рН 7,2, стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. Перед употреблением в рас­плавленный агар (50 °С) добавляют 3 % дрожжевого экстракта и 0,2 % сухого активированного угля и 0,5 ЕД/мл пенициллина. Компоненты перемешивают и разливают по чашкам Петри.

Дифференциально-диагностические среды. Предназначены для выявления ферментов у микроорганизмов. По консистенции мо­гут быть жидкими, полужидкими, плотными. В состав этих сред входят основная питательная среда, обеспечивающая рост изуча­емого микроорганизма, субстрат для обнаружения фермента и индикатор, по изменению цвета которого судят о сдвиге рН сре­ды в результате расщепления субстрата.

К питательным средам такого типа относят среды Гисса, Эндо, Плоскирева, Левина и др.

Среды Гисса используют для изучения ферментатив­ных свойств выделенных культур микроорганизмов. К 100 мл ди­стиллированной воды добавляют 1 % пептона, 0,5 г хлорида на­трия. Компоненты растворяют, фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают рН 7,0...7,4, добавляют один из углево­дов-субстратов (лактоза, глюкоза и т.д.), агар-агар (0,3...0,4 %), а затем 1мл индикатора Андрэдэ или 0,1мл 1,6%-го раствора бромтимолового синего. Готовую среду разливают по 3 мл в про­бирки, стерилизуют текучим паром три дня подряд по 30 мин или при 112 °С 20 мин.

Выпускают сухие среды Гисса с индикатором BP - смесь вод­но-голубого с розоловой кислотой (готовые среды - полужидкой консистенции).

Плотные дифференциально-диагностические среды применя­ют для первичной изоляции возбудителей из материала. В их со­став нередко кроме известного субстрата входят вещества, при­дающие питательной среде селективные свойства.

Среда Эндо содержит лактозу в качестве субстрата и предназначена для дифференциации бактерий, различающихся по способности расщеплять лактозу.

К 1000 мл расплавленного МПА (рН 7,4) температурой 70 °С добавляют 1 г лактозы, предварительно растворенной в неболь­шом количестве дистиллированной кипяченой воды. В отдель­ных пробирках готовят: 2...3 мл спиртового раствора основного фуксина; 10 мл 10%-го водного раствора сульфата натрия.

В стерильную пробирку вносят 1 мл раствора фуксина и до­бавляют раствор сульфита натрия до обесцвечивания фуксина. Приготовленную смесь вливают в расплавленный агар, переме­шивают и разливают по чашкам Петри. Готовая среда бесцветна, при росте на ней микроорганизмов, расщепляющих лактозу, сре­да закисляется, обесцвеченный фуксин восстанавливается, и ко­лония микроорганизма, например эшерихий, приобретает крас­ный цвет с металлическим оттенком. Среду готовят за сутки до ее использования. Выпускают также сухую среду Эндо. Перед упот­реблением определенную навеску порошка вносят в дистиллиро­ванную воду, кипятят и разливают по чашкам Петри.

Среда Левина аналогична по целевому назначению среде Эндо, но содержит другой индикатор (эозин с метилено-вым синим). К 100 мл расплавленного МПА (рН 7,2...7,4) добав­ляют 2 мл 0,5%-го водного раствора метиленового синего, 1,5 мл 2%-го раствора эозина желтого, 2 г лактозы, 0,2 г дигидрофосфата калия. Растворы красителей готовят на дистиллированной воде, стерилизуют текучим паром 60 мин. Лактозу и дигидрофос-фат калия предварительно разводят в небольшом количестве сте­рильной дистиллированной воды и кипятят. Колонии лактозопо-зитивных бактерий на этой среде окрашены в фиолетово-черный цвет.

Агар Плоскирева предназначен для выделения саль­монелл, содержит лактозу в качестве субстрата и компоненты, подавляющие рост сопутствующей микрофлоры. Среду выпуска­ют в виде порошка, в ее состав кроме питательной агаровой ос­новы входят: желчные соли, цитрат натрия, тиосульфат натрия, фосфат натрия, бриллиантовый зеленый, кальцинированная сода, йод, хлорид натрия, лактоза, нейтральный красный. Навес­ку порошка растворяют в воде, кипятят и разливают в чашки Петри. Готовая среда прозрачная или розоватая. Колонии саль­монелл бесцветные, эшерихий - брусничного цвета.

Методы культивирования микроорганизмов. Наряду с общими принципами культивирование микроорганизмов различных фи­зиологических групп имеет некоторые особенности Культивирование аэробных и факультативно-анаэробных бак­терий. Плотные, жидкие или полужидкие питательные среды, засеянные чистыми культурами микроорганизмов или исследуе­мым материалом, помещают в термостаты (рис. 34), поддержива­ющие оптимальную для данного микроорганизма температуру. При температурах, превышающих верхнюю границу нормы, бак­терии не только замедляют рост, но и быстро гибнут. При темпе­ратуре ниже оптимальной скорость роста микроорганизма посте­пенно замедляется.

У мезофилов температурный оптимум находится в интервале 30...37 ºС, у психрофилов - 10... 15 ºС, у термофилов - 50...60 ºС.

Микроорганизмы в процессе культивирования на питатель­ных средах при условии, что в среды не вносят дополнительные вещества, постепенно замедляют и затем прекращают свой рост из-за истощения питательного субстрата, изменения оптималь­ных значений биофизических показателей (рН, Eh и т.д.). Такое культивирование микроорганизмов называют периодическим. Если при этом жидкую питательную среду в процессе инкубирования посевов не перемешивают, то такой способ куль­тивирования определяют как стацио­нарный. При диагностических бакте­риологических исследованиях обыч­но используют именно такой способ культивирования. В биологической промышленности при производстве вакцин и других биопрепаратов, ког­да необходимо достичь максимально­го выхода бактериальной массы или экзотоксинов, применяют периодическое культивирование в жидких средах с их интенсивным перемешиванием.

При таких задачах аэробные бактерии культивируют в колбах, бутылях на шюттель-аппаратах с частотой колебания 150... 250 мин-1, что облегчает передачу бактериям кислорода и пита­тельных компонентов.

Рис. 35. Схема ферментера для глубинного культивирования аэробных микроорганизмов.

1 – вход воздуха; 2 – выход воздуха; 3 – отбойники; 4 – мешалка; 5 - барботер

Наиболее эффективное культивирование бактерий в жидких питательных средах с максимальным выходом биопродукта дос­тигают в ферментерах. Ферментеры (реакторы) представляют со­бой металлические или стеклянные культуральные сосуды емко­стью от 500 мл до 1000 л (рис. 35). При культивировании бакте­рий в ферментерах среду перемешивают специальными мешал­ками с одновременной подачей необходимого количества стерильного воздуха. Ферментеры конструируют как автономные системы с автоматической регуляцией температуры и рН среды. В ферментерах также осуществляют непрерывное (проточное) культивирование, при котором в отличие от периодической куль­туры автоматически в среду подаются свежие питательные ком­поненты со скоростью, равной удалению аналогичного объема выросшей культуры бактерий. Такое непрерывное культивирова­ние в хорошо отрегулированной системе в принципе можно про­должать неограниченно долго.

Культивирование анаэробных бактерий. Облигатные анаэро­бы - бактерии, у которых энергетический и конструктивный ме­таболизм происходит без молекулярного кислорода 02. У таких микроорганизмов в процессе дыхания конечными акцепторами

электронов являются окись углерода (IV), ионы сульфата, фумарат и др. Кроме того, молекулярный кислород действует на многие анаэробы губительно. Например, строгие анаэробы погибают при незначительных концентрациях кислорода (бактероиды, фузобак-терии), умеренные анаэробы менее чувствительны (С. perfringens ), аэротолерантные анаэробы могут расти в условиях обычной ат­мосферы (молочнокислые бактерии). Большинство болезнетвор­ных анаэробов относят к строгим или умеренным анаэробам. Для их культивирования используют специальные питательные среды и газовые смеси. Последними наполняют анаэростаты.

Необходимое условие роста облигатных анаэробов - не столько отсутствие молекулярного кислорода, сколько низкий ОКВП питательных сред. Резко восстановительных условий достигают, добавляя в среды редуцирующие (восстанавливающие) вещества и одновременно удаляя из них молекулярный кисло­род. В качестве редуцирующих веществ в питательные среды добавляют химические соединения, приведенные в таблице 1.

1. Восстанавливающие вещества для культивирования анаэробов

С этой же целью в питательные среды вносят вареные кусоч­ки печени, мышц, мозга, кровяные сгустки, куриный яичный бе­лок, зерна ржи. Считают, что в этих тканях сильное редуцирую­щее действие оказывают вещества, богатые SH-группами.

Для создания условий анаэробиоза питательные среды макси­мально освобождают от кислорода путем кипячения, а также пропуская через жидкие среды инертные газы или наслаивая на поверхность питательной среды вазелиновое масло для предотв­ращения контакта с кислородом воздуха.

Мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ) Китта-Тароцци - традиционная среда для культиви­рования анаэробов. Ее основой служит печеночная вода, кото­рую готовят путем кипячения в воде мелких кусочков говяжьей печени (соотношение 1:1). Печеночную воду смешивают с МПБ в соотношении 1:2, смесь кипятят, устанавливают необходимый рН и разливают в пробирки по 10 мл. В пробирки добавляют ку­сочки вареной печени (восстановитель) и затем вносят по 2 мл вазелинового масла. Автоклавируют при 0,5 атм 20 мин. Перед употреблением пробирки со средой кипятят в водяной бане, за­тем охлаждают и только после этого проводят посев.

Для выращивания анаэробов используют также питательные среды с повышенной вязкостью, поскольку диффузия кислорода в них затруднена.

Полужидкий агар: к МПБ добавляют 0,25...0,75 % агара, 1 % глюкозы, устанавливают рН 7,4, разливают в пробирки высоким столбиком и дробно стерилизуют.

Практикуют культивирование анаэробов в толще плотных сред.

Сахарный агар в трубках Вейона: к 2%-му МПА добавляют 1 % глюкозы, устанавливают рН 7,4. Посевной материал вносят в расплавленную и охлажденную до 48...50 "С среду, перемешивают и разливают по стерильным узким стек­лянным трубкам - трубкам Вейона (длина 20...25 см, диаметр 1...1,5 см). Концы трубок закрыты стерильными резиновыми пробками. Колонии анаэробов вырастают в толще питательной среды.

Широко применяют культивирование анаэробов на поверхно­сти плотных питательных сред в чашках Петри.

Из числа плотных сред для культивирования анаэробов до­вольно часто используют кровяной агар с глюкозой и железо-сульфитный агар.

Глюкозо-кровяной агар: к 3%-му МПА (рН 7,2...7,4), расплавленному и охлажденному до 50°С, добавляют 1...2% стерильного раствора глюкозы, 15...20% дефибриниро-ванной крови барана и разливают по чашкам Петри.

Железо-сульфитный агар (среда Вильсон-Блера): к 100 мл 3%-го МПА (рН 7,4) с 1 % глюкозы при температуре 60 °С добавляют 10 мл 20%-го раствора сульфита натрия и 1мл 8%-го раствора хлорида железа, затем среду разливают по чаш­кам Петри. Анаэробы при росте на этой среде восстанавливают сульфит натрия до сульфата натрия, который реагирует с хлори­дом железа, образуя черный осадок сульфита железа; колонии бактерий окрашены в черный цвет.

Для культивирования анаэробов на поверхности плотных пи­тательных сред недостаточно добавления в них восстанавливаю­щих агентов. Культуральные сосуды с посевами помещают в гер­метические камеры (анаэростаты), в которых тем или иным спо­собом создают анаэробные (бескислородные) условия.

Обычный анаэростат представляет собой металлический ци­линдр, который герметически закрывает крышка с резиновой прокладкой (рис. 36). На крышке размещены манометр и краны для откачивания воздуха или наполнения анаэростата инертным газом (азот). Воздух откачивают с помощью вакуумного насоса, закручивают вентиль и анаэростат с пробирками или чашками помещают в термостат. Обычное остаточное давление в анаэро-стате около 10 мм рт. ст. Созданы анаэростаты, удаление кисло­рода из которых происходит за счет его реакции с водородом в

присутствии катализатора (платино­вый, палладиевый). Водород в камеру закачивают из баллона через редук­тор. Некоторые анаэробные камеры снабжены нагревательными элемен­тами с терморегулирующим устрой­ством, обеспечивающим автономное поддержание температуры на необхо­димом уровне.

Культивирование микроаэрофильных бактерий. Хотя микроаэрофильные бактерии по типу дыхания аэро­бы, они растут не в обычной атмос­фере (21 % кислорода), а с понижен­ным содержанием кислорода. Например, Campylobacter fetus рас­тет в атмосфере, содержащей не более 6 % кислорода. Такую ат­мосферу можно создать в герметичных термостатах, анаэростатах, заменяя часть воздуха сжатым оксидом углерода (IV) из бал­лона, или в обычном эксикаторе. В последнем случае пробирки с посевами помещают в эксикатор вместе с бюксом, содержащим ватку, смоченную спиртом, или свечу. Вату (свечу) зажигают и закрывают крышку эксикатора. Пламя затухает по мере выгора­ния кислорода, и снижение его содержания достаточно для роста микроаэрофилов.

Наиболее доступен и эффективен способ культивирования микроаэрофилов в полужидкой среде с 0,1...0,4 % агара. В такой среде конвекционные потоки не способны перемешивать верхние, богатые кислородом слои среды с нижними, что создает в среде, заполняющей пробирку, градиент концентрации кислоро­да. Культуру микроаэрофила засевают уколом, и микроорганизм растет в зоне с оптимальным содержанием кислорода, обычно в виде тонких дисков на расстоянии от нескольких миллиметров до нескольких десятков миллиметров от поверхности среды.

Культивирование грибов. Лучший рост грибов отмечен на сре­дах с содержанием углеводов 1...4%. При первичной изоляции для подавления роста различных сопутствующих бактерий в пи­тательные среды часто добавляют антибиотики.

Агар Сабуро применяют для культивирования возбуди­телей дерматомикозов и кандидамикоза. Глюкоза -4 г, пеп­тон - 1 г, агар - 1,8 г, дистиллированная вода - 100 мл. После растворения агара среду фильтруют, разливают по пробиркам и стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. После стерилизации рН среды 6,9...7,0.

Агар Чапека используют для культивирования грибов многих видов. Глюкоза - 30 г, нитрат натрия - 2 г, дигидрофос­фат калия - 1, сульфат магния - 0,5 г, хлорид калия - 0,5 г, сульфат железа -0,0012 г, агар -20 г, дистиллированная вода - 1000 мл. Естественный рН среды 5,6...5,9. Среду стерилизуют при 0,5 атм 30 мин.

Сусло-агар предназначен для культивирования возбу­дителей дерматомикозов и кандидамикоза. Солодовое неохме-ленное сусло разбавляют водопроводной водой в соотношении 1: 2 (до содержания Сахаров 7 %), устанавливают рН 6,5...6,7, до­бавляют 2 % агара, кипятят, фильтруют, стерилизуют при 0,5 атм 30 мин.

Агар Литмана пригоден для культивирования дерматофитов. Пептон - 10 г, глюкоза - 10 г, бычья желчь - 15 г, кристаллвиолет -0,01 г, агар -20 г, дистиллированная вода- 1000 мл. Среду стерилизуют при 1 атм 15 мин.

Среда Ван-Итерсона предназначена для выделе­ния из кормов токсичных грибов, вызывающих стахиботриотоксикоз, дендродохиотоксикоз и др. Нитрат аммония - 0,5 г, ди­гидрофосфат калия - 0,5 г, водопроводная вода - 1000 мл. Среду стерилизуют при 1 атм 30 миц. Затем средой увлажняют стериль­ные чашки Петри с фильтровальной бумагой.

Жидкая среда Чапека. Глюкоза - 30г, нитрат на­трия - 2 г, дигидрофосфат калия - 1 г, сульфат магния - 0,5 г, хлорид калия -0,5 г, сульфат железа - 0,001 г, дистиллирован­ная вода - 1000 мл. Среду стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. После стерилизации рН среды 5,9...6,2. Жидкую среду можно использо­вать для увлажнения фильтровальной бумаги в чашках Петри с целью последующего культивирования грибов.

Среда Билай предназначена для получения макроко­нидий грибов. Нитрат калия - 2 г, дигидрофосфат калия - 1 г, сульфат магния -0,5 г, хлорид калия -0,5 г, сульфат железа - следы, крахмал растворимый - 0,1 г, сахароза - 0,1 г, глюкоза - 0,1 г, дистиллированная вода - 1000 мл. Среду разливают по про­биркам по 5 мл и в каждую пробирку вставляют полоску фильт­ровальной бумаги таким образом, чтобы большая часть ее нахо­дилась над раствором. Среду стерилизуют при 1 атм 20 мин.

Глюкозный бульон Сабуро используют для культивирования грибов многих видов. Глюкоза - 40 г, пептон - Юг, дистиллированная вода- 1000мл. Нагревают до кипения, разливают по пробиркам и стерилизуют при 1 атм 15 мин.

Культивирование на волосах по Ван-брейзегему применяют при выделении дерматофитов. Здоровые стерильные волосы прикрепляют коллодием к стек­лянной трубочке. На середину волос наносят культуру гриба. Трубочку помещают в цилиндр, на дно которого для влажности наливают небольшое количество воды. Культивируют при 25 "С пять-десять дней и более.

Для выделения возбудителей гистоплазмоза, эпизоотического лимфангита применяют кровяной агар.

ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ

1. Приготовить скошенный МПА, сывороточный и кровяной
МПА.

2. Изучить устройство анаэростата и ферментера.

Контрольные вопросы

1.Какие общие требования предъявляют к питательным средам?

2.На какие группы классифицируют питательные среды?

Как культивируют анаэробы и микроаэрофилы

СПЕЦИАЛЬНЫЕ (ЭЛЕКТИВНЫЕ) ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Среды для выращивания дрожжей

Синтетическая среда Ридера

В состав среды входят, г/л: сульфат аммония 3, сульфат магния 0,7, нитрат кальция 0,04, хлорид натрия 0,5, дигидрофосфат калия 1,0, гидрофосфат калия 0,1. Начальный pH 6,6. В состав среды можно не вводить нитрат кальция, который дрожжами не используется. Для изучения размножения дрожжей добавляют 2% сахара, для исследования брожения - 5-10%. Полная синтетическая среда содержит кристаллические витамины, мкг/мл: инозит 5, биотин 0,0001, пантотеновая кислота 0,25, тиамин 1,0, пиридоксин 0,25, никотиновая кислота 0,5. Стерилизуют среду в автоклаве при давлении 0,1 М Па в течение 20 мин.

Глюкозоаммонийная среда

Содержит в 1 л водопроводной воды следующие вещества, г: сульфат аммония 5, дигидрофосфат калия 0,85, гидрофосфат калия 0,15, сульфат магния 0,5, хлорид натрия 0,1, хлорид кальция 0,1, глюкоза 20, агар 20. Для обогащения факторами роста добавляют дрожжевой (0,2%) или мясной (0,3%) экстракт и виноградный сок.

Синтетическая среда для выявления несовершенных дрожжей

Содержит в 1 л водопроводной воды следующие вещества, г/л: глюкоза 50, лизин 3, дигидрофосфат калия 1, сульфат магния 1, сульфат железа - следы. Каждый компонент растворяют в воде отдельно и добавляют в указанном порядке. В среду добавляют агар (1,5%), расплавляют, разливают по пробиркам и стерилизуют 20 мин при давлении 0,05 МПа.

Полная среда с лизином для выявления несовершенных дрожжей

Содержит в 1 л водопроводной воды следующие вещества, г/л: глюкоза 50, сульфат магния 1, дигидрофосфат калия 2, лактат калия 12 мл (50%-й раствор), /,(+) моногидрат лизина 1, витаминный раствор (на 100 мл стерильной дистиллированной воды добавляют, г: инозитола 2, пантотената кальция 0,4, никотинамида 0,5, гидраттиамина 0,1, агар 20; pH среды - 5-5,2. Среду разливают в пробирки по 15 мл и стерилизуют 15 мин при давлении 0,1 МПа.

Среда с ацетатом для обнаружения несовершенных дрожжей

На 1 л водопроводной воды берут 10 г ацетата натрия, 10 г хлорида аммония, 5 г глюкозы, 3 мл дрожжевого автолизата, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют при давлении 0,05 МПа в течение 30 мин.

Среда для выявления посторонних дрожжей, морфологически схожих с основной культурой

10 г пептона, 2 г гидрофосфата калия растворяют в 500 мл дистиллированной воды, фильтруют. В фильтрате расплавляют 15 г агара, добавляют 10 г глюкозы, 0,4 г эозина и 0,065 мл метиленового синего (90%-го спиртового раствора), доводят до 1000 мл горячей дистиллированной водой, разливают по пробиркам и стерилизуют 15 мин при давлении 0,1 МПа. При стерилизации цвет исчезает, при охлаждении снова появляется. Хранят среду не более 2 мес.

Среда для образования псевдомицелия

Глюкозопептонный агар. К 1 л водопроводной воды добавляют, г: пептон 10, глюкоза 20, агар 30-35. Стерилизуют 30 мин при давлении 0,05 МПа. При необходимости можно добавить дрожжевой или мясной экстракт (0,5%) или готовить в жидком виде.

Картофельный агар. 100 г очищенного, вымытого, тонко нарезанного картофеля настаивают в прохладном месте несколько часов с 300 мл водопроводной воды. Вытяжку фильтруют, 230 мл вытяжки доводят водопроводной водой до 1 л, добавляют 20 г глюкозы, 30-35 г агара, расплавляют и стерилизуют 1 ч при давлении 0,075 МПа.

Дрожжевая вода с углеводами («цветной ряд»)

Способность дрожжей вызывать брожение углеводов определяют на дрожжевой воде с 2% исследуемого сахара (глюкоза, мальтоза, сахароза, лактоза, раффиноза и др.). Среду разливают в пробирки с поплавками, трубки Дунбара и стерилизуют дробно текучим паром. Учет результатов после засева ведут через 2 сут, при необходимости через 7 сут выращивания при температуре 30 °С.

Способность дрожжей усваивать углеводы путем окисления исследуют на среде следующего состава, r/л: сульфат аммония 5, дигидрофосфат калия 1, сульфат магния 0,5, автолитат 1, исследуемый сахар 10, агар 20. Среду разливают по пробиркам, стерилизуют 30 мин при давлении 0,05 МПа, приготавливают скошенный агар. Рост культур оценивают через 3-4 сут.

Дрожжевой агар с сахаром

В дрожжевой воде растворяют 0,5% хлорида натрия, 1% глюкозы (либо 4 или 10% сахарозы) и 2% агара, pH 6,8 (с глюкозой) и 6-6,5 (с сахарозой). Среду разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при давлении 0,05 МПа в течение 30 мин.

Среды с антибиотиками

Для преимущественного развития дрожжей и подавления сопутствующих бактерий в среды вводят антибиотики широкого спектра действия: стрептомицин (100 ед/мл), пенициллин (20-100 ед/мл), левомицитин (50 мг/л), неомицин (20 ед/мл) и др. Их можно добавлять в среду как вместе, так и по отдельности.

Среды для аскоспорообразования

Среда Городковой. Содержит в 1 л водопроводной воды, г: пептон 10, хлорид натрия 5, глюкоза 1 (или 2,5), агар 20; pH среды 7,3. Разливают по пробиркам и стерилизуют 15 мин при давлении 0,1 МПа.

Ацетатный агар Мак-Клари. К 1 л дистиллированной воды добавляют, г: ацетат натрия 8,2, хлорид калия 1,8, глюкоза 1, дрожжевой экстракт 2,5, агар 15. Автоклавируют 15 мин при давлении 0,1 МПа.

Среда Старки. В 1 л водопроводной воды растворяют, г: гидрофосфат калия 1, дигидрофосфат калия 0,25, сульфат магния 0,25, хлорид кальция 0,05, агар 20. Стерилизуют при давлении 0,05 МПа 15 мин.

Среда для выращивания осмофильных дрожжей

На 1 л глюкозного сиропа (50-60% СВ) добавляют 5 г пептона и 20 г агара. Пептон можно заменить дрожжевой водой (50 мл). Стерилизуют при давлении 0,05 МПа.

Мелассное сусло

200-300 г густой мелассы смешивают с водой в соотношении 1: 3, нагревают до температуры 95 °С и дают отстояться в течение 2 ч. При этом оседают коагулировавшие коллоиды и мелассный раствор осветляется. К раствору добавляют 3% диаммонийфосфата, разбавляют водой до 5-8% СВ и разливают в пробирки или колбы. Для приготовления агаризованной среды добавляют 1,5-2% агара. Стерилизуют при давлении 0,05 МПа 30 мин в автоклаве или дробно 1 ч с интервалом 20-24 ч 3 раза.

Среды для выращивания мицелиальных грибов

Свекловичный агар

Хорошо вымытую сахарную свеклу нарезают ломтиками, заливают водопроводной водой (20 г свеклы на 1 л воды) и кипятят в течение 30 мин. Фильтрат доводят водой до первоначального объема, прибавляют 2% агара и стерилизуют при давлении 0,1 МПа в течение 30 мин.

Свекловичная мезга

Чистую свеклу измельчают на терке, раскладывают в чашки Петри и, не переворачивая, стерилизуют при давлении 0,1 МПа в течение 30 мин.

Среда Чапека

Состав среды, г/л: сахароза или глюкоза 30, дигидрофосфат калия 1,0, нитрат натрия 2,0, сульфат магния 0,5, хлорид калия 0,05, сульфат железа 0,1, агар 20. Навеску агара выщелачивают и добавляют к указанным ингредиентам, предварительно растворенным в 1 л дистиллированной воды, прогревают текучим паром, устанавливают pH 4,0-5,5 10%-м раствором лимонной кислоты или гидроксида натрия. Фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют дробно текучим паром 3 раза по 30 мин с интервалом 1 сут.

Сахаронитратный агар Чапека-Докса

Вариант 1. На 1 л дистиллированной воды берут, г: сахарозы 20, гидрофосфата калия 0,5, сульфата магния 0,5, хлорида натрия 0,5, нитрата калия 1, сульфата железа - следы, карбоната кальция 2-5, агара 20.

Вариант 2. На 1 л дистиллированной воды берут, г/л: сахароза 30, нитрат аммония 2,5, дигидрофосфат калия 1, сульфат магния 1, сульфат железа 0,01, агар 20.

Глюкозокрахмальная среда

Те же солевые компоненты, что и в сахарозонитратном агаре Чапека, но вместо сахарозы берут 25 г растворимого крахмала и 5 г глюкозы.

Крахмалоаммиачный агар

Состав среды, г/л: растворимый крахмал 10, карбонат кальция 3, гидро- фосфат калия 1, сульфат магния 1, хлорид натрия 1, сульфат аммония 1, агар 20. Стерилизуют в течение 30 мин при давлении 0,05 МПа.

Среда Сабуро

К 100 мл стерильной дрожжевой воды добавляют, г: пептон 5, глюкоза 4, агар 1,8-2. Стерилизуют в течение 20 мин при давлении 0,05 МПа или дробно.

Основой этой среды служит дрожжевая вода. Для приготовления дрожжевой воды 70-100 г свежих прессованных дрожжей (7-10 г сухих дрожжей) кипятят в течение 20-30 мин в 1 л дистиллированной воды и отстаивают в высоком цилиндре на холоде в течение 12 ч. Отстоявшуюся жидкость декантируют, добавляют еще 1 л воды, кипятят 30 мин, фильтруют, доводят pH до требуемого значения. Приготовленную среду стерилизуют дробно по 20 мин 2-3 с интервалом 1 сут. К 100 мл стерильной дрожжевой воды добавляют 1% пептона, 2% агара, после растворения агара вносят 4% глюкозы или мальтозы, фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют при давлении 0,05 МПа в течение 20 мин.

Среду можно готовить и на обычной 1%-й пептонной воде.

Среды для выращивания молочнокислых бактерий

Гидролизованное молоко (по Богданову)

Обычное или обезжиренное (обрат) молоко (pH 7,6-7,8) кипятят в течение 5 мин, сосуд тщательно встряхивают и охлаждают до температуры 45 °С и на 1 л добавляют 0,5-1 г панкреатина, через 4-7 мин добавляют 5 мл хлороформа. Помещают в термостат на 18-20 ч при температуре 40 °С. Порошок панкреатина следует предварительно развести в небольшом количестве теплой воды. В течение первых часов молоко несколько раз перемешивают при открытой пробке. Гидролизованное молоко фильтруют через бумажный фильтр, разводят в 2-3 раза водой, устанавливают pH 7,0-7,2 и стерилизуют в течение 15 мин при давлении 0,1 МПа или в течение 20 мин при давлении 0,05 МПа.

Агар с гидролизованным молоком

В гидролизованное молоко вносят 1,5-2,0% агара. Смесь нагревают до кипения и выдерживают до полного растворения агара. Горячую среду фильтруют через ватный фильтр, разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при давлении 0,1 МПа в течение 10-15 мин.

Обезжиренное молоко с индикатором

Свежее, нагретое до кипения обезжиренное молоко подкрашивают в горячем состоянии лакмусовой настойкой до интенсивного сиреневого цвета. Стерилизуют текучим паром (3 раза по 30 мин с интервалом 1 сут) или автоклавированием в течение 10 мин при давлении 0,1 МПа.

Солодовое сусло с дробиной

Приготовляют солодовое сусло, но без отделения дробины (12-15% СВ). Разливают в пробирки, вносят стерильный мел (2-4%) и стерилизуют при давлении 0,05 МПа в течение 30 мин.

Дрожжевой агар с сахарозой

Для выявления Lactobacillus и Leuconostoc используют среду, приготовленную на основе дрожжевой воды с добавлением 0,5% хлорида натрия, 10% сахарозы и 2% агара; pH среды 6-6,5.

Ростковая среда

25 г солодовых (ячменных) ростков кипятят в течение 10 мин с 500 мл воды и после остывания до температуры 45-50 °С фильтруют через полотняный мешочек, осветляют взбитым куриным белком, вновь кипятят и фильтруют через бумажный фильтр для удаления свернувшегося белка. К раствору добавляют 1,5% пептона, 2% сахара, 2% агара и стерилизуют в течение 30 мин при давлении 0,05 МПа.

Капустная среда

200 г измельченной белокочанной капусты заливают 1 л воды, кипятят в течение 10 мин, отжимают через два слоя марли. Полученною жидкость фильтруют через складчатый фильтр, разводят в 2 раза и к отвару добавляют 2% глюкозы и 1% пептона, Разливают в пробирки и стерилизуют при давлении 0,05 МПа в течение 15 мин. Для получения плотной среды добавляют 2% агара.

Среда МРС (среда де Мана)

В состав среды входят, г/л: сульфат марганца 0,05, сульфат магния 0,2, гидрофосфат калия 2, нитрат аммония 2, ацетат натрия 5, пептон 10, дрожжевой экстракт Дифко 5, мясной экстракт 10, глюкоза 20, твин-80 1мл, pH среды 6-6,5. Среду фильтруют и стерилизуют дробно по 30 мин 3 раза с интервалом 1 сут или в автоклаве при давлении 0,05 МПа в течение 20 мин. Применяют в жидком, полужидком и агаризованном виде для родов Leuconostoc и Lactobacillus.

Среды МРС (в модификации А.А. Ланциера)

Среда МРС-1. В 200 мл дистиллированной воды растворяют, г: сульфат марганца 0,05, сульфат магния 0,2, цистеин 0,2, гидрофосфат калия 2, цитрат аммония 2, ацетат натрия 5, глюкоза 20, пептон 10, твин-80 1 мл (растворяют отдельно в небольшом количестве горячей дистиллированной воды), дрожжевой автолизат (см. Приложение 2) 50 мл, печеночный экстракт 100 мл. Объем жидкости доводят дистиллированной водой до 500 мл и добавляют 500 мл гидролизованного обезжиренного молока Богданова, предварительно не стерилизованного, pH 6,2-6,8. Среду фильтруют и стерилизуют дробно текучим паром.

Среда МРС-2. Предназначена для музейного хранения штаммов Lactobacillus. Готовят на основе среды МРС-1 с добавлением 0,15% агара. Получается полужидкая среда, создающая более анаэробные условия по сравнению с жидкой.

Среда МРС-3. Предназначена для «пестрого ряда» при идентификации молочнокислых бактерий. Основу ее составляет среда МРС-1, но без глюкозы, печеночного экстракта и гидролизованного молока. Углеводы и многоатомные спирты добавляют в количестве 0,5%. Количество вносимого агара - 0,15%. pH среды 7,0. Индикатором служит хлорфеноловый красный (0,004%). Индикатор растворяют в 1-2 мл этилового спирта и прибавляют к среде перед стерилизацией. Хлорфеноловый красный дает переход окраски среды от красно-фиолетового к желтому в пределах pH 4,8-6,4.

Печеночный экстракт

Свежую говяжью печень мелко разрезают и заливают водой (на 1 кг печени 1 л воды). Кипятят в течение 30 мин и фильтруют, после чего стерилизуют при давлении 0,05 МПа в течение 20 мин.

Среда 10

На 1 л неохмеленного пивного сусла (8% СВ) или 1 л дрожжевой воды добавляют, г: сульфат марганца 0,05, сульфат магния 0,2, цистин или цистеин 0,2, гидрофосфат калия 2, цитрат аммония 0,2, ацетат натрия 2,5, сахароза 20, пептон 10, дрожжевой автолизат 50 мл. Каждый компонент растворяют в указанном порядке в солодовом сусле (для Lactobacillus) или дрожжевой воде (для Leuconostoc). В первом случае pH среды 5,5, во втором - 6,0. Добавляют 1,5% агара и стерилизуют текучим паром. В чашки Петри можно добавить стерильный мел.

В 150 мл профильтрованного томатного сока растворяют при подогревании 0,75 мл твин-80 и 37,5 г глюкозы, прибавляют 5 мл дрожжевого автолизата, 600 мл обезжиренного молока (обрата) и 150 мл расплавленного 2%-го мясопептонного агара. pH устанавливают равным 7,0. Среду разливают в пробирки по 6-7 мл, стерилизуют при давлении 0,05 МПа в течение 20 мин, охлаждают, засевают исследуемыми молочнокислыми бактериями и сверху наслаивают 1-2 мл расплавленного 2%-го мясопептонного агара. В случае слабого газообразования пробка отделяется от основной среды, при сильном газообразовании поднимается высоко или вылетает из пробирки.

Среды для выращивания слизеобразующих бактерий

Вариант 1. Мясопетонный агар с 10% сахарозы.

Вариант 2. Состав, г/л: сахар-сырец 40, гидрофосфат натрия 2, хлорид натрия 0,5, сульфат магния 0,1, сульфат железа 0,01, карбонат кальция 10, агар 20.

Среда Виттенбари

В состав среды входят, г/л: мясной экстракт 5, пептон 5, дрожжевой автолизат 50 (или дрожжевой экстракт 50), 1,6%-й раствор бромкрезолового пурпурного 1,4 мл, pH 6,8-7,0. Стерилизуют текучим паром 3 раза по 45 мин с интервалом 1 сут.

Среды для выращивания гнилостных аспорогенных бактерий

Молочный агар

Обезжиренное молоко разливают по 5 мл в пробирки и стерилизуют текучим паром или в автоклаве в течение 20 мин при давлении 0,05 МПа. Отдельно готовят 3%-й водный агар, разливают по 4-5 мл в пробирки и стерилизуют в течение 30 мин при давлении 0,1 МПа. Агар расплавляют, стерильно соединяют с молоком и заливают в чашки Петри, куда предварительно внесена исследуемая проба.

Среды для выращивания жирорасщепляющих бактерий

Вариант I. К 1 л воды добавляют 5 г пептона и 3 мл дрожжевого автолизата. Установив pH 7,2-7,4, добавляют 1,5% агара. Агар расплавляют, среду фильтруют и добавляют 1% горячего молочного жира или оливкового масла. Перемешивают, разливают по пробиркам и стерилизуют при давлении 0,1 МПа в течение 15 мин.

Вариант 2. К мясопептонному агару добавляют 2-4% молочного жира или оливкового масла. Разливают по 10 мл в пробирки и стерилизуют при давлении 0,1 МПа в течение 20 мин. Перед внесением в чашки среду тщательно встряхивают.

Примером такой среды может служить желатина с гидролизованным молоком. К гидролизованному молоку (можно использовать гидролизо- ванный казеин или мясопептонный бульон) добавляют 10% желатины, дают ей набухнуть и нагревают при помешивании до температуры 50 °С. pH среды 7,0-7,2. Среду фильтруют и стерилизуют в пробирках при давлении 0,075 МПа в течение 20 мин.

Среды для выращивания уксуснокислых бактерий

К солодовому суслу или капустной среде добавляют 4 об. % этилового спирта и 20 ед/мл антибиотика мономицина, подавляющего рост молочнокислых бактерий.

Среды для выращивания анаэробов

Среда Виноградского. В 1 л дистиллированной воды растворяют, г: гидрофосфат калия 1, сульфат магния 0,5, сульфат марганца 20, глюкоза 20, хлорид натрия и хлорид железа - следы.

Среда Кита-Тароцци. Проваренные и промытые водой кусочки печени или мяса опускают в пробирку, чтобы они покрывали дно. Наливают мясопептонный бульон с 1% глюкозы (pH 7,2-7,4) на "/ 2 объема пробирки и опускают поплавок. Сверху наливают слой вазелинового масла высотой 1 см. Стерилизуют по 15 мин при давлении 0,1 МПа 2 раза с интервалом 30 мин.

Среда для выращивания термофильных анаэробов, образующих сероводород

В состав среды входят, г/л: пептон 10, сульфат железа 1, агар 20. Перед розливом в каждую пробирку помещают чистый железный гвоздь. После засева сахара в пробирку наливают слой стерильного вазелинового масла. При наличии в сахаре сероводородообразующих бактерий в агаре образуются характерные черные колонии.

микроорганизм анаэробный культивирование микробиология

Для культивирования микроорганизмов используются различные по составу питательные среды, в которых должны содержаться все вещества, необходимые для роста. Потребности микроорганизмов в питательных веществах чрезвычайно разнообразны и определяются особенностями их метаболизма. Поэтому универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех микроорганизмов, не существует.

В широком смысле слова питательная среда должна соответствовать следующим требованиям :

1) включать доступный для клетки источник энергии. Для одних организмов (фототрофов) таким источником служит свет, для других - органический (хемоорганотрофы) или неорганический (хемолитотрофы) субстрат.

2) содержать все необходимые компоненты для реализации конструктивных процессов в клетке. Причем синтетические способности микроорганизмов могут варьировать от использования углекислого газа в качестве единственного источника углерода (автотрофы) до потребности в более восстановленных соединениях углерода - кислотах, спиртах, углеводах и др. (гетеротрофы).

В узком смысле слова любая искусственная питательная среда должна соответствовать следующим требованиям : содержать все необходимые для роста питательные вещества в легко усвояемой форме; иметь оптимальную влажность, оптимальную вязкость, оптимальную рН, (оптимальные - для конкретного микроорганизма), быть изотоничной, сбалансированной с высокой буферной емкостью и, по возможности, прозрачной.

Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения микроорганизмов, их культивирования и сохранения в лабораторных или промышленных условиях.

Выбор состава питательной среды зависит в значительной степени от целей эксперимента либо промышленного процесса.

Существует следующая классификация питательных сред :

· По составу питательные среды делятся на натуральные, синтетические и полусинтетические . Также они могут классифицироваться как среды определенного и неопределенного состава. Натуральными называют среды, которые состоят из продуктов растительного или животного происхождения, имеющих неопределенный химический состав . Примерами питательных сред такого типа являются среды, представляющие собой смесь продуктов распада белков (казеина, мышц млекопитающих), образующихся при их гидролизе. К питательным средам неопределенного состава можно отнести и среды, полученные на основе растительного сырья: картофельный агар, томатный агар, отвары злаков, дрожжей, пивное сусло, настои сена и соломы и др. Основное назначение таких питательных сред - выделение, культивирование, получение биомассы и поддержание культур микроорганизмов.

К числу сред неопределенного состава относят и среды полусинтетические . В такую среду вносят известные соединения как явно необходимые; а также добавляют небольшое количество дрожжевого или кукурузного экстракта (или любого другого природного продукта) для обеспечения неизвестных потребностей роста. Такие среды часто используются в случае промышленного культивирования биологических объектов для получения продуктов метаболизма, например, для получения аминокислот, антибиотиков, витаминов и т.д.

Синтетические среды - это среды определенного состава , представленные чистыми химическими соединениями, взятыми в точно указанных концентрациях и соотношениях отдельных элементов. Обязательными компонентами таких сред являются неорганические соединения (соли) и углерод- и азотсодержащие вещества (типичными представителями являются глюкоза и (NH 4) 2 SO 4 . Часто к таким средам добавляют буферные растворы и хелатирующие соединения. Основное назначение таких питательных сред - изучение особенностей физиологии и метаболизма микроорганизмов, выделение генетических рекомбинантов и т.д.

· По назначению среды разделяют на основные , элективные (селективные) и дифференциально-диагностические . К основным относятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий. Это питательный бульон и питательный агар. Такие среды служат основой для приготовления более сложных питательных сред. Элективные среды обеспечивают преимущественное развитие одного или целой физиологической группы микроорганизмов. Например, для выделения стафилоккоков в среду может быть добавлен хлористый натрий в концентрации 7,5%. При этой концентрации рост других бактерий подавляется. Элективные среды применяются на первом этапе выделения чистой культуры бактерий, т.е. при получении накопительной культуры.

Дифференциально-диагностические среды применяются для быстрой идентификации близкородственных видов микроорганизмов, для определения видовой принадлежности, в клинической бактериологии и др. В состав дифференциально-диагностической среды входят: а) основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий; б) определенный химический субстрат, отношение к которому является диагностическим признаком для данного микроорганизма; в) цветной индикатор, изменение окраски которого свидетельствует о биохимической реакции и наличии данной ферментной системы у исследуемого микроорганизма. Например, среда Эндо позволяет отличить клоны, сбраживающие лактозу от клонов, не обладающих этим свойством.

· По консистенции среды могут быть жидкими, полужидкими, твердыми, сыпучими . Жидкие питательные среды получают при растворении в воде определенного необходимого набора питательных веществ, макро- и микроэлементов. По составу они могут быть как натуральными, так и синтетическими.

· Среды в твердом состоянии в форме плотных гелей используются в бактериологии со времен Р. Коха. Наиболее важным преимуществом использования твердых сред является то, что на них можно выращивать микроорганизмы в виде колоний, образующихся из отдельных клеток популяции. Приготовление твердых питательных сред достигается добавлением к жидким средам определенных уплотнителей, в качестве которых могут выступать агар, желатина, силикагель, каррагенан.

Полужидкие среды содержат гелеобразующее вещество в низкой (0,3 - 0,7%) концентрации и имеют мягкую желеподобную консистенцию. Такие среды пригодны для изучения подвижности и хемотаксиса клеток, культивирования микроаэрофилов.

Сыпучие среды представляют собой массу в той или иной степени измельченного и увлажненного сырья (обычно, растительного). Основное их назначение - использование в пищевой промышленности (получение соевого соуса или рисовой водки), сельском хозяйстве (силосование кормов) и т.д.

В бактериологической практике чаще всего используются сухие питательные среды, которые получают в промышленных масштабах - триптические гидролизаты дешевых непищевых продуктов (рыбные отходы, мясокостная мука, технический казеин) с добавлением агара. Сухие среды являются достаточно дешевым сырьем, могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке, имеют относительно стандартный состав, на их основе быстро и легко готовить питательные среды.

Необходимость культивирования микробов связана не только с целью выделения возбудителя болезни из исследуемого материала и определения его вида, но и для накопления микробной массы при изготовлении биологических препаратов: вакцин, антигенов и аллергенов. Для культивирования микроорганизмов в лабораторных условиях применяют различные искусственные питательные среды.

Питательные среды бывают: по консистенции - жидкие, плотные, полужидкие; по происхождению - животного, растительного происхождения и синтетические среды постоянного состава; по назначению - обычные, или простые, для выращивания большинства микроорганизмов; специальные - для культивирования микробов, не растущих или плохо растущих на обычных питательных средах; дифференциально-диагностические - употребляемые для определения родовых или видовых особенностей исследуемых бактериальных культур (гемолитических, сахаролитических, протеолитических, редуцирующих и других свойств); селективные - для выделения микробов одного рода или вида из материала, содержащего смесь разных видов микроорганизмов, на которых одни виды хорошо растут, а другие не растут; среды обогащения (накопительные).

Основой многих питательных сред животного происхождения является мясная вода. Ее готовят из свежего нежирного говяжьего мяса, освобожденного от костей, фасций, сухожилий. Измельченное мясо (мелкие кусочки или фарш) заливают дистиллированной водой в соотношении 1: 2 (на 1 кг мяса 2 л воды). Экстрагируют 12-24 ч, кипятят 1,5- 2 ч, фильтруют, добавляют дистиллированной воды до первоначального объема, разливают в бутыли, колбы, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют в автоклаве.

Обычные (простые) среды.

Мясо-пептонный бульон (МПБ) - жидкая питательная среда. Для его приготовления к 1 л мясной воды добавляют 1% пептона, 0,5% химически чистой поваренной соли и кипятят. Мясная вода слабокислой реакции, поэтому МПБ подщелачивают - добавляют небольшое количество 10- 15%-ного раствораКОН или NaOH, кипятят 2-3 мин, проверяют рН при помощи компаратора Михаэлнса (рис. 30) или электропотенциометром. Мясо-пептонный бульон фильтруют через бумажный фильтр, разливают по пробиркам, автоклавируют.

Мясо-пептонный агар (МПА) - плотная питательная среда. К МПБ добавляют 2% агар-агара (без-азотистое органическое вещество, полученное из морских водорослей) и кипятят до его расплавления, в горячем виде устанавливают рН, кипятят 5-10 мин, фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки или колбочки, автоклавируют. После стерилизации горячие пробирки с агаром раскладывают наклонно под углом 5-6°. При застывании образуется скошенная плотная поверхность.

Мясо-пептонный полужидкий агар готовят так же, как и МПА; различие заключается в том, что агар-агара добавляют меньше - 0,15-0,20-0,25%.

Специальные питательные среды.

Бульон Мартена. Свиные желудки (или сычуги рогатого скота) очищают от жира, фасций, измельчают в мясорубке, заливают водой 1: 4 и добавляют 1% (кобъему жидкости)соляной кислоты. Смесь выдерживают при 50° 24 ч, нейтрализуют 20%-ным раствором NaOH до щелочной реакции по лакмусу, автоклавируют при 120° 15 мин. Для приготовления бульона смешивают равные количества мясной воды и полученной смеси, кипятят 10 мин, подщелачивают 20%-ным раствором NaOH до рН 7,9, кипятят 30 мин, фильтруют, разливают в пробирки, автоклавируют при 0,5 атм (110°) 30 мин.

Добавление 2% агара обеспечивает получение плотной среды - агар Мартена.

Бульон Хоттингера готовят из триптического гидролизата (перевара) мясных отходов - фасций, жира, сухожилий. .1 кг мясных обрезков заливают 2 л кипящеЙ воды, кипятят 5 мин, охлаждают до 45° и добавляют 5,0-10,0 панкреатина, подщелачивают до рН 7,8-8,0 углекислым натром, встряхивают и доливают хлороформ (10 мл на 1 л), плотно закрывают, выдерживают в теплом месте 10 дней, ежедневно встряхивая. Полученный перевар подкисляют соляной кислотой до рН 5,5. Хранят в темном месте. Для приготовления питательной среды к 1 л воды добавляют 100-200 мл полученного перевара, кипятят 1-2 мин, фильтруют, подщелачивают, стерилизуют. Агар Хоттингера готовят так же, как и обычный МПА.

Сахарный (глюкозный) бульон (или агар) изготавливают как обычные среды, но к ним добавляют 1-2% глюкозы и стерилизуют текучим паром или автоклавируют при 0,5 атм.

Мясо-пептонная желатина. К МПБ добавляют 10-20% желатины (продукт, получаемый из клейдающих тканей животных), расплавляют и в горячем виде устанавливают нужную реакцию среды, пропускают через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки, стерилизуют текучим паром дробно.

Мясо-пептонный печеночный бульон Китт - Тароцци - жидкая среда для культивирования анаэробов. Печень крупного рогатого скота нарезают мелкими кусочками, заливают водой 1:1, кипятят, фильтруют и печеночную воду добавляют к МПБ 2: 1 (на 2 л МПБ 1 л печеночного отвара), кипятят, устанавливают рН, разливают по пробиркам высоким столбиком, в которые предварительно положены кусочки вареной печени. В пробирки поверх среды наливают 1-2 мл вазелинового масла и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм 30 мин.^

Сывороточный бульон и сыворо-точный мясо-пептонный агар готовят путем асептического добавления к МПБ или расплавленному н охлажденному до 45-50° МПА 5-10% стерильной сыворотки крови лошади (или барана, кролика), затем сывороточный бульон разливают в стерильные пробирки (колбы).

Сывороточный МПА разливают или в пробирки (столбиком) . или в чашки Петри.

Дифференциально-диагностические среды. Кровяной МПА применяют для выявления гемолитических свойств бактерий. Предварительно в стерильную колбочку со стеклянными бусами асептично берут кровь (у барана, лошади или кролика), встряхивают 15-20 мин, чтобы фибрин отделить от остальной массы крови. Фибрин сгустками осаждается на бусах и дефибринированную кровь (5-10%) стерильно добавляют к расплавленному и остуженному МПА, легким вращением колбочки равномерно смешивают и разливают в стерильные чашки Петри.

Среды Гисса. В пептонную воду (состоящую из дистиллированной воды, 0,5% NaCl и 1% пептона) добавляют 0,5% углевода (сахар или многоатомный спирт) и 0,5% индикатора Андрэдэ. Обычно готовят набор сред с разными углеводами, каждый в отдельности. Используемый индикатор представляет собой 0,5 г кислого фуксина, 16 мл 4%-ного раствора NaOH, 100 мл дистиллированной воды. Среды с углеводами разливают в пробирки с «газовками» (поплавками), опущенными в пробирки вверх дном. Стерилизуют среды с углеводами текучим паром дробно. . Среды Гисса могут быть жидкие и полужидкие- (без газовок), содержащие 0,25% агара. При ферментации того или _иного углевода микробом, растущим в данной среде, образуется кислота, под действием которой восстанавливается цвет краски индикатора. Среда приобретает красный цвет. Образовавшиеся прн ферментации углевода газообразные продукты скапливаются в поплавках.

Среда Эндо. В расплавленный МПА (рН 7,4- 7,6) вносят 0,5-1% лактозы и 0,5% насыщенного спиртового раствора основного фуксина, обесцвеченного добавлением по каплям 10%-ного сернокислого натрия. Среду кипятят и разливают в чашки Петри. Бактерии, сбраживающие лактозу, на этой среде растут в виде красных колоний.

Среда Левина. Готовят 2%-ный агар на бульоне Хоттингера, рН 7,2-7,4, стерилизуют в автоклаве. К 100 мл готового расплавленного агара добавляют: 2 мл 0,5%-ного раствора метиленовой синьки, 1,5 мл 2%-ного эозина (щелочного бактериологического), 2 г лактозы и 0,2 г двуосновного фосфорнокислого калия (КаНРО4). Растворы красителей готовят на дистиллированной воде и стерилизуют в аппарате Коха. Раствор метиленовой синьки перед употреблением подогревают на водяной бане и добавляют к агару в теплом виде. После добавления этих компонентов среду тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Среда фиолетового цвета.

Висмут-сульфит агар (среда Вильсон- Блера). МПА (рН 7,5) с индикатором, содержащим лимонно-кислый висмут, сернокислый натрий, соль Мора (серноаммонийная соль железа), двуосновной фосфорнокислый натрий, глюкозу и бриллиантовую зелень. В настоящее время висмут-сульфит агар (как и агар Эндо, среду Плоскирева) промышленность выпускает в сухом порошкообразном виде. 6 г сухого порошка растворяют в 100 мл дистиллированной воды, подогревают при непрерывном помешивании, разливают в стерильные пробирки и оставляют в наклонном положении. Применяют также среды с химическими веществами, которые изменяют окраску в результате окислительно-восстановительных (редуцирующих) процессов, обусловленных ферментами бактерий. . Для этого готовят молоко с метиленовой си нько й. Свежее обезжиренное коровье молоко подщелачивают двууглекислым натром до слабощелочной реакции по лакмусовой бумажке, добавляют 1%-ный водный раствор метиленовой синьки да голубого окрашивания. Стерилизуют текучим паром дробно.

Если есть предположение, что в исследуемом материале имеется небольшое количество бактерий, то рекомендуют использовать среды накопления (обогащения). С р ед а Шустовой: к МПА (рН 7,4) добавляют 10% 50%-ного водного раствора гипосульфита и 2% раствора Люголя. Применяют для накопления бактерий паратифа. Среда Раппопорт: к МПБ добавляют 1% глюкозы, 10% желчи и 1% индикатора Андрэде. Стерилизуют текучим паром.

Синтетические среды применяют для изучения метаболизма бактерий и других биологических особенностей. Их составляют из химически чистых растворимых в воде веществ, в строго определенных количествах: фосфорнокислого аммония, фосфорнокислого калия, хлористого натра, сернокислого магния, глюкозы или другого углевода, никотинамида и др. По мере необходимости готовят плотные синтетические среды путем добавления агара. Стерилизуют в автоклаве. (Синтетические среды Моделя, Соттона

Для культивирования дрожжей и плесневых грибов используют следующие среды

Синтетическая среда Ван-Итерсона : азотнокислого аммония (NaH4NO3) 0,5, калия фосфорнокислого одноосновного (КН2РО4) 0,5, воды водопроводной 1 л. Автоклавируют при 1 атм 20 мин.

Глюкозный агар Сабуро: глюкозы 4,0, пептона 1,0, агара 1,8, воды 100 мл. Стерилизуют автоклавироваиием.

Агар Литмана с бычьей желчью: пептона 10,0, глюкозы 10,0, обезвоженной бычьей желчи 15 мл, кристаллвиолета 0,01, воды 1 л, агара 20,0. Стерилизуют в автоклаве при 1 атм 15 мин. Разливают в*чашки толстым слоем, чтобы предупредить обезвоживание среды.